Diese Veröffentlichung enthält ein Protokoll zeigt, wie die Aktivität des rekombinanten Proteins Phosphatase 2A katalytische Untereinheit (PP2Ac) Messen in Reaktion auf rekombinante α-Synuclein, β-Synuclein oder γ-Synuclein Proteine mit einem einfachen farbmetrischen Assay. Feststellungen zur Spezifität der α-Synuclein in Richtung PP2Ac zeigen wir im Gehirn der Maus.
Α-Synuclein (aSyn), β-Synuclein (bSyn) und γ-Synuclein (gSyn) sind Mitglieder einer konservierten Familie von Chaperon-ähnliche Proteine, die hoch in vertebrate neuronalen Geweben exprimiert werden. Von den drei Synucleins hat nur aSyn stark bei neurodegenerativen Erkrankungen wie Morbus Parkinson, Demenz mit Lewy-Körpern und Multiple System Atrophie verwickelt. In der Untersuchung normal aSyn Funktion, zeigen Daten, dass aSyn stimuliert die Aktivität der katalytischen Untereinheit der eine reichlich ausgedrückt dephosphorylating Enzym, PP2Ac in Vitro und in Vivo. Vorherige Daten zeigen, dass aSyn Aggregation im menschlichen Gehirn PP2Ac Aktivität in Regionen mit Lewy-Körper Pathologie, reduziert in der löslichen aSyn unlöslich geworden ist. Da alle drei Synucleins beträchtliche Homologie in der Aminosäure-Sequenzen haben, wurden jedoch Experimente entwickelt, um zu testen, ob alle PP2Ac Aktivität modulieren kann. Mit rekombinanten Synucleins und rekombinante PP2Ac Protein, wurde Aktivität von Malachitgrün farbmetrischen Assay bewertet. Daten zeigten, dass alle drei rekombinante Synucleins PP2Ac Aktivität in zellfreien Assays stimuliert, Anhebung der Möglichkeit, dass die konservierte Homologie zwischen Synucleins alle drei homologen, mit der Fähigkeit verleihen kann zu binden und die PP2Ac zu aktivieren. Co-Immunopräzipitation Daten zufolge jedoch wahrscheinlich PP2Ac Modulation durch endogene Wechselwirkungen zwischen aSyn und PP2Ac in Vivoauftritt.
Die Verteilung der Synucleins in Gehirn und Rückenmark zeigen, dass alle drei Synucleins in den neuralen Geweben angereichert sind definiert, obwohl unterschiedliche Muster der Lokalisierung wurden Studien berichtet1. Z. B. aSyn ist am häufigsten vorkommende an präsynaptischen Standorten in Hirnrinde und Basalganglien2,3, bSyn hat eine gleichmäßigere Verteilung im Gehirn und Rückenmark4,5und gSyn ist häufiger im Rückenmark und periphere Ganglien6. Obwohl einige embryonalen Ausdruck alle Synucleins auftreten kann, werden drei homologen häufiger während der Neugeborenen Periode4,5,6,7,8. Bemerkenswert ist, Daten aus Synuclein triple Knockout-Mäusen zeigen, dass Verlust von allen drei Synucleins Alter Beginn neuronale Dysfunktion9, unterstützen wichtige Synuclein Funktionen im zentralen Nervensystem (ZNS)10, verursacht 11. es ist noch nicht bekannt, ob Synuclein triple Knockout-Mäusen Veränderungen in PP2Ac Verteilung oder Aktivität zeigen. Daten aus einzelnen Synuclein-Knockout-Mäusen zeigen, dass Verlust der aSyn allein in der Lage, PP2Ac Aktivität im Gehirn12deutlich zu reduzieren. Neben der CNS lokalisieren Sie alle Synucleins in andere Gewebe im gesamten Körper13,14,15.
Wegen seiner etablierten genetischen Verbindungen zur Neurodegeneration16,17wird aSyn gehört zu den besten der drei Synucleins untersucht. Perez-Labor hat lange daran gearbeitet, die um normalen funktionelle Aktivitäten des aSyn, vor allem in der CNS11,12,18,19,20,21zu definieren, 22,23 und seit kurzem in peripheren Geweben24,25. Unter diesen war die Entdeckung, dass aSyn spielt eine wichtige regulatorische Rolle in anregenden PP2Ac Aktivität19. PP2A Aktivität trägt allgemein zur normalen Gehirnfunktion, einschließlich der für die Regulierung der Dopamin-Produktion-26. Die PP2A Holoenzym besteht aus drei unabhängigen Untereinheiten, die katalytische Untereinheit C PP2Ac, ein Baugerüst A-Untereinheit und eines mehrere verschiedene regulatorische/Ausrichtung B Untereinheiten, die helfen, PP2A zu bestimmten subzellulären Microdomains, wodurch PP2A lokalisieren funktionale Diversität27. Belege dafür, dass aSyn Interaktionen mit PP2Ac zum die Phosphatase-Aktivität in Vitro und in Vivo12,19,21,23Beitrag, 25. Wenn aSyn sammelt sich in Protein-Aggregate, wie bei der Lewy Körper Form innen Neuronen von Parkinson und Demenz mit Lewy-Körpern (DLB), Gewebe mit aggregierten aSyn haben PP2Ac Aktivität23,25vermindert, wenn Ebenen der löslichen aSyn verringern. Angesichts der Tatsache, dass alle drei Synucleins deutliche Homologie28 haben (aSyn teilt 66 % Identität mit bSyn und 56 % mit gSyn) und die aSyn trägt zur Aktivierung des PP2Ac, es wurde die Hypothese aufgestellt, dass alle Mitglieder der Adelsfamilie Protein Synuclein möglicherweise Steigerung der PP2Ac Aktivität, zumindest in Vitro. Um dies zu beurteilen, wurde als Reaktion auf rekombinante aSyn, bSyn und gSyn mit einem einfachen farbmetrischen Assay, modelliert nach der Methode von Fathi Et Al. PP2Ac Aktivität gemessen. 29. diese Methode und die neuen Erkenntnisse sind hier aufgeführt.
Malachitgrün Assays mit pT wurde verwendet, um PP2Ac-Aktivität zu messen, weil es einfacher durchzuführen als die klassische Methode, die 32P-gekennzeichnete Substrate verwendet. Ein weiterer Vorteil dieser Assay über radioaktive Proben ist, dass Radioisotope einige Gefahr und können teuer werden, vor allem 32P-markierte Moleküle haben kurze Halbwertszeiten, die beschränkt die Anzahl der Tests, die man ausführen kann, bevor Reagenzien ablaufen. Verschwenden Sie mit Malachitgrün, anstatt Radioaktivität auch die Notwendigkeit beseitigt zu entsorgen, 32P. Malachitgrün-Assays sind auch sehr empfindlich bei der Messung der Aktivität von Serin/Threonin Phosphatasen im Vergleich zu anderen farbmetrischen Assay, die verwendet das Substrat p-Nitrophenylphosphate (pNPP), die ist nicht selektiv, da es sein kann Rezeptorsignals von einer Vielzahl von Enzymen32.
Kommerzielle Malachitgrün Sets, PP2A Aktivität zu messen sind seit einiger Zeit verfügbar und wurden zuvor im Labor eingesetzt. Allerdings wurde dabei viele Malachitgrün-Assays, solche Sets zu teuer. Darüber hinaus kommerzielle Kits für PP2A Aktivität sind nur für ein Jahr stabil, während mit Reagenzien für die Form Puderzucker und bieten fachgerechte Lagerung leicht zugänglich Assay-Komponenten, die für längere Zeit strukturell stabil sind.
Vor der Prüfung bSyn und gSyn, aSyn diente als Positivkontrolle, PP2Ac Aktivität zu stimulieren und zu bestimmen, die Höhe der PP2Ac für die Assays erforderlich, und auch zu bestätigen, dass die resultierende Daten bleiben auf der Skala mit der Standardkurve (150-2400 Pmol PO4 ). Es ist bemerkenswert, dass wenn aSyn PP2Ac regt zu stark, obwohl die Reaktion in der Regel linear ist, Daten Skala erlischt und Chemikalien in der MGT-Lösung auszufällen, macht es unmöglich, genaue Mengen freigegeben frei-PO4 mit einem Teller zu messen Reader.
Angesichts der Tatsache, dass aSyn beiträgt, um PP2Ac Aktivität in Vivo und in Vitro12,19,21,23,25, und dass alle Synucleins beträchtliche Homologie, es war gewesen die Hypothese, dass alle Familienmitglieder Synuclein möglicherweise in der Lage, PP2Ac in Zelle kostenlose Tests zu stimulieren. Mit Hilfe des kolorimetrischen Tests beschrieben hier wurde festgestellt, dass in der Tat, alle drei rekombinante Synucleins (aSyn, bSyn, gSyn) stimuliert PP2Ac Aktivität, Anhebung der Möglichkeit, dass alle drei Synucleins im Nervensystem ähnliche Funktionen ausführen kann. Jedoch Gehirn von Parkinson oder Demenz mit Lewy-Körper-Fälle haben weniger PP2Ac Aktivität in Geweben mit hoch aggregierten aSyn23. Maus-Gewebe beherbergen Lewy-Körper-wie Pathologie auch ausstellen reduziert PP2Ac Aktivität25. Dies, und neue Daten in Abbildung 3 sowie vorherige Daten von aSyn Knockout Mäuse12, stark darauf hin, dass weder bSyn noch gSyn in der Regel den Verlust der löslichen aSyn kompensieren kann im Gehirn, oder alternativ, dass die Synuclein homologe können nicht Ordnen Sie PP2Ac so stark wie aSyn wie abgebildet (Abb. 3). Allen Brain Atlas zeigt NS1 von allen drei Synuclein mRNAs in vielen Bereichen des Gehirns, und zwar dreifach-Synuclein-Knockout-Mäusen wurden generierten9,33, PP2Ac Aktivität in diesem Modell nicht bewertet worden ist. Interessanterweise aSyn, die auf Ser129 von Polo-Like Kinase 2, phosphoryliert wird ist weniger in der Lage, PP2Ac12zu aktivieren, aber Beweise für bSyn hier gezeigten empfehlen, dass bSyn Phosphorylierung unwahrscheinlich, PP2Ac Aktivität zu beeinflussen ist, wie sehr wenig bSyn kam mit PP2Ac im Gehirn der Maus (Abbildung 3). Zusammen genommen, die Daten deuten darauf hin, dass endogene PP2Ac Aktivität Modulatoren, wie aSyn, wahrscheinlich zu Wellness und Krankheit beitragen.
Das Protokoll hier skizzierten ist eine einfache, aber wirkungsvolle Technik, um die Fähigkeit des PP2Ac, ein Phosphopeptide Substrat in Reaktion auf verschiedene Behandlungen dephosphorylate bestimmen. Zum Beispiel kann diese dieselbe Methode, andere PP2Ac Aktivatoren wie Ceramide sowie möglicher neuer Therapeutika34, zu testen oder zur Bewertung der Auswirkungen von PP2Ac Inhibitoren in Vitroverwendet werden. Es ist auch wichtig, darauf hinzuweisen, dass ähnliche Tests können die Aktivität der PP2Ac messen, die von 1 6 isoliert worden Immunopräzipitation Zellextrakte oder Körpergewebe, wie oben beschrieben die Autoren12,19, 25. Zukunft Anwendungen für Malachitgrün-Assay existieren jenseits Messung PP2Ac Aktivität, da ATP Tätigkeit auch mit solch einem Assay ermittelt werden kann.
Beachten Sie, dass eine Standardkurve jedes Mal für jeden unabhängigen PP2Ac Assay generiert werden muss. Es ist zwingend erforderlich, um sicherzustellen, dass alle verwendete Reagenzien Phosphat frei, wie freie Phosphate künstlich Hintergrundsignal erhöhen und falsche Ergebnisse zu produzieren. Am Tag des Tests ist es wichtig, genügend frische MGT-Lösung für alle Proben untersucht werden vorzubereiten. Außerdem ist MGT nur gut der Tag, an dem es gemacht ist und neigt zu überstürzen sich nach ein paar Stunden. PP2Ac von einem Händler gekauft und gespeichert muss Aliquotted werden eingefroren, sobald sie eingegangen ist, um Einfrieren Auftauen Zyklen zu verhindern, die seine Aktivität zu reduzieren. Wie andere Phosphatasen pT-Substrat (z.B. PP1 und PP535), dephosphorylate können bei der Analyse der Zelle oder eines Gewebes Auszüge in der PP2Ac nicht durch Immunopräzipitation lokalisiert worden Proben müssen übergangen werden Spalten, freie Phosphate zu entfernen und spezifische Inhibitoren der Phosphatasen müssen zur Phosphatase Spezifität, wie zuvor beschrieben18zu bestätigen.
The authors have nothing to disclose.
Die Autoren schätzen Bemühungen durch vorherige Labor Mitglieder Kendra Mackett, Sandra Slusher und Jie Chen, gearbeitet, um die Methode zu optimieren. Die Autoren danken auch der National Institutes of Health, Michael J. Fox Foundation, Texas Tech University Health Sciences Center El Paso wissenschaftliche Aktivität Forschung Projekt (SARP), Lizanell und Colbert Coldwell Stiftung, mehrfache System Atrophie Koalition, Hoy Familienforschung und Anna Mae Doyle Geschenk Mittel für die finanzielle Unterstützung dieser Forschung.
Reagent | |||
1 M Trizma Base | Sigma-Aldrich | T15003 | |
CaCl2 (calcium chloride) | Fisher Scientific | C70-500 | |
Concentrated HCl | JT Baker | 9535-33 | |
Ammonium molybdate | Sigma-Aldrich | A1343 | |
Malachite green oxalate salt | Sigma-Aldrich | M6880 | |
Tween 20 | Sigma-Aldrich | P9416 | |
Threonine phosphopeptide (KRpTIRR) | New England peptide LLC | BP12-011 | |
KH2PO4 (potassium phosphate) | Sigma-Aldrich | 795488 | |
Recombinant human PP2A C subunit | Cayman Chemical | 10011237 | |
Recombinant human α-synuclein | rPeptide | S-1001-2 | |
Recombinant human β-synuclein | rPeptide | S-1003-2 | |
Recombinant human γ-synuclein | rPeptide | S-1007-2 | |
PP2Ac 1D6 antibody | Millipore | 05-421 | |
PP2Ac antibody 1D6 | Novus Biologicals | NB100-92217 | |
aSyn antibody C-20 | Santa Cruz Biotechnology | sc-7011-R | |
bSyn antibody EP1537Y | Novus Biologicals | NB100-79903 | |
gSyn antibody E-20 | Santa Cruz Biotechnology | sc-10698 | |
Zeba Spin Desalting Columns, 7K MWCO, 0.5 mL | Thermo-Fisher Scientific | 89882 | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Equipment/Software | |||
Multiskan Spectrum Plate Reader | Thermo Fisher Scientific | 51118650 | |
Prism Software | GraphPad, San Diego, CA, USA | ||
pH Meter | Fisher Scientific | 13-636-AB15P |