組換え α β γ Synucleins 携帯無料試金蛋白質ホスファターゼ 2 a 触媒サブユニット活性を刺激します。

Summary

このパブリケーションは、組換え α-シヌクレイン、β シヌクレイン、または単純な比色試金を使用して γ シヌクレイン蛋白質への応答で組換えタンパク質脱燐酸化酵素 2 a 触媒サブユニット (PP2Ac) の活性を測定する方法を示すプロトコルを示します。マウス脳における PP2Ac に対する α-シヌクレイン特異性に関する知見を紹介します。

Abstract

Α-シヌクレイン (非同期) と β シヌクレイン (bSyn)、γ シヌクレイン (gSyn) は、脊椎動物の神経組織で高発現しているシャペロンのような蛋白質の保存ファミリーのメンバーです。3 つの synucleins の非同期のみは、パーキンソン病、多系統萎縮症とレビー小体認知症などの神経変性疾患に強く関与しています。通常非同期関数を勉強のデータを示す、非同期、豊かに表現された dephosphorylating の酵素、PP2Ac in vitroとin vivoの触媒サブユニットの活性を刺激します。前のデータは、人間の脳で非同期集約が、可溶性非同期が不溶性になるレビー小体型体病理学がある地域で PP2Ac 活動を減少させることを示します。ただし、すべての 3 synucleins がアミノ酸配列の相同性をかなりあるため実験は PP2Ac の活動を調節することができますすべての場合をテストするため設計されました。組換え synucleins と PP2Ac の組換え蛋白質を使用して、アクティビティをマラカイト グリーンの比色定量法によって評価しました。データは、すべて 3 組換え synucleins が PP2Ac synucleins で保存された相同性可能性がありますにバインドし、PP2Ac を有効にする能力を持つすべての 3 つの同族体を授けること可能性を高める細胞試金活動を刺激することを明らかにしました。Co 免疫沈降データはただし、非同期と生体内でPP2Ac の内因性相互作用を通じて PP2Ac 変調の可能性がありますが発生することをお勧めします。

Introduction

ローカリゼーションの変動パターンが脳・神経組織ですべての 3 synucleins が濃縮され、脊髄を synucleins の分布を定義する研究報告¹です。たとえば、非同期は、大脳皮質と大脳基底核^2,3シナプス前サイトの最も豊富な bSyn は、脳と脊髄の^4、5より均一な分布と gSyn 脊髄で豊富であります。および末梢神経節⁶。すべての synucleins のいくつかの胚の式可能性があります発生しませんが、3 つの同族体は、新生児期^4,5,6,7、8時に豊かになります。驚くことに、シヌクレイン トリプル ノックアウト マウスからのデータを示す年齢発症神経機能障害⁹、中枢神経系 (CNS)^10,重要なシヌクレイン機能をサポートをすべての 3 つの synucleins の損失に原因¹¹. シヌクレイン トリプル ノックアウト マウス PP2Ac 配布または活動の変更を表示する場合それはまだ知られていません。単一シヌクレイン ノックアウト マウスからのデータでは、単独で非同期の損失は脳¹²の PP2Ac 活動を大幅に削減することができることを明らかにします。中枢神経系、に加えてすべての synucleins を体^13,14,15で他の組織にローカライズします。

神経変性^16,17に確立された遺伝リンクがその、ため非同期最高の間で検討した 3 つの synucleins の。ペレス研究室は特に中枢神経系^11,12,18,の^{19,20,21、非同期、通常の機能的な活動を定義するくらい働いてください。 22,23}と最近では末梢組織^24,25。これらのうち、その非同期を発見された刺激的な PP2Ac 活動¹⁹の主要規制の役割を果たしています。PP2A 活動はドーパミン生産²⁶の規制では、正常な脳機能に広く貢献します。3 つの独立した亜単位、触媒 C サブユニット、PP2Ac、足場 A サブユニットといくつか異なる規制/ターゲット B サブユニットの特定細胞内のミクロ相分離構造を PP2A を提供する PP2A をローカライズするために、1 つから成っている PP2A ホロ酵素機能的多様性²⁷。証拠は、PP2Ac との非同期対話がホスファターゼ活性の in vitroとin vivo^{12,19,21,23に大きく貢献することを示しています。 25}。非同期は、レビー小体型はレビー小体 (DLB) を伴うパーキンソン病や認知症の神経細胞内のフォームを体の場合とタンパク質凝集体に蓄積、組織集約された非同期 PP2Ac 活動^23,25を減少しているときは、水溶性の非同期のレベルを減少させます。すべての 3 つの synucleins を持つ重要な相同性²⁸ (非同期は、bSyn と gSyn 56% と 66% の相同を共有) とその非同期 PP2Ac の活性化に貢献する、仮説シヌクレイン蛋白ファミリーのすべてのメンバーがすることができます少なくとも PP2Ac 活動を高める体外。Fathiら法をモデルにした簡易比色定量法を用いた gSyn、bSyn、組換え非同期応答するために、PP2Ac 活動を測定しました。²⁹します。 このメソッドは、新しい調査結果はここに詳細な。

Protocol

1. バッファーおよび試薬の調製 P-ニトロフェニル (同時) リン酸バッファーの準備 とおり 50 mL の同時バッファーを準備します。 0.30285 g のトリスの基本を重量を量る (材料の表を参照してください)、25 mL の脱イオン水に溶解します。 120 mM CaCl241.6 μ L を追加します。1 M 塩酸で pH 7.0 に調整し、超高純度の脱イオン水にて 50 mL に最終的な解決の容積をもたらします。 最終濃度が 50 mM トリス-HCl、100 mM CaCl2, pH 7.0 であることを確認します。 4 oc 以上で同時バッファーを格納します。 マラカイト グリーン ソリューションは、次を準備します。 67.2 mL 4 M 塩酸溶液を作成する超高純度の脱イオン水に濃塩酸の 32.8 mL を追加することによって、溶液を準備します。注: 安全ゴーグル、マスク、使い捨て手袋を使用して発煙のフード マラカイト溶液を調製します。 モリブデン酸アンモニウムの 4.2 g を計量し、溶液 a. 95.8 mL に追加するソリューション Bの準備します。 0.045 g マラカイト グリーンしゅう酸塩を計量し、超高純度の脱イオン水 100 mL に最終の総容積をもたらすに追加することによってソリューション Cを準備します。 1:3 (v/v) 比、室温で 1 時間攪拌ソリューション B と C を混ぜて溶液を準備します。 0.22 μ m 孔サイズ ニトロセルロース膜フィルター ユニットを介して 50 mL の注射器を使用して、ソリューション開発をフィルターします。 保管準備マラカイト 4 oC 光から保護ソリューションです。 活性化剤の準備 1% を準備するには、トゥイーン 20 ソリューション、ピペット 10 μ L の純水の 990 μ L にトゥイーン 20 脱イオン トゥイーン 20 まで渦が完全に溶解し、水 (v/v)。 マラカイト グリーン トゥイーン 20 (MGT) 実用的なソリューションの準備。 1: 100 (99 μ L からマラカイト グリーン ソリューションに例えば1 μ L アクティベーター) の割合でマラカイト グリーン ソリューション (ソリューション開発、ステップ 1.2.5) と活性化 (手順 1.3) をミックスします。 トレオニンのリン酸化ペプチド (KRpTIRR) (pT) の準備基板。 氷の上 1 mg リン酸化ペプチド バイアル 2 mM 在庫、場所を準備するには、超高純度の脱イオン水とゆっくり溶解する渦の 550 μ L を追加します。 〜 10 の因数を作成し、-20oc 以上で pT を格納 シヌクレイン準備 使い捨て手袋、マスク、安全ゴーグルを使用して発煙のフード synucleins を準備します。 最終濃度 1 mg/mL の超純水脱イオン水を 1 mL で組換えシヌクレインの 1 mg を再懸濁します。 解散し、氷の場所に優しく渦。 50 μ L の因数を準備し、-80 oc 以上で保管 リン酸基準の作成 とおり 0.1 mM リン酸原液を準備します。 0.1361 g KH2PO4重量を量り、80 mL の超純水の脱イオン水をビーカーに配置します。攪拌棒及び溶解してミックスを追加します。卒業シリンダーにソリューションのすべてを転送し、超高純度の脱イオン水 100 mL に最終の総容積をもたらします。 0.22 μ m 孔サイズ ニトロセルロース膜フィルター ユニットを介して 50 mL 注射器; を使用してソリューション全体をフィルター処理します。最終濃度は、10 mM です。 希釈のソリューション (10 mM) 1: 100 で。最終濃度は、0.1 mM リン酸塩 (PO4) 測定基準に使用するになります。 4 oc 以上でリン酸原液を保存します。 希釈 1250 μ L の最終的な総量で PO4規格に使用を制限するための表 1 を参照してください。表 1 に従って 1.5 mL チューブにリン酸と超高純度の脱イオン水の適切な量を追加します。 店準備-20 oc 以上で PO4基準 リン酸基準 0.1 mM PO4ソリューション (mL) 0 75 150 300 600 1,200 超純水、純水 (mL) 1,250 1,175 1,100 950 650 50 PO4 [pmol] の最終濃度 0 150 300 600 1,200 2,400 表 1: リン酸基準。 2. PP2A アッセイ組換え Synucleins に応答 注: 実験者は synucleins の各サンプルに対して使用量に合わせて同時バッファーの最初のボリュームを適切に調整する必要がありますので、各反作用のための合計の最終巻は 60 μ L をします。ほとんどの場合、40 と 44 μ L の間同時バッファーのボリュームになります。 手順に従って各 PP2Ac 反応を準備します。 1.5 mL チューブで氷の上同時バッファーの場所 39 μ L を追加します。 人間の組換え PP2Ac の 1 μ L (105 ng/μ L または 0.0007 U/μ L) を追加 (rPP2Ac)。 0、1.5、7.5、15、または 0、0.1、0.5 の最終濃度の同時バッファーで rPP2Ac に 30 μ M synucleins の 4 μ L、1.0 と 2.0 μ M を追加し、4 ° c 回転ユニットの上で 30 分間加温最終巻は 60 μ L になります。 30 分後、氷し、2 mM pT 基板の 16 μ L を追加するサンプルを移動します。 各 PP2A アッセイ混合断続的な揺れと水浴中に 30 ° C で 10 分間、インキュベートします。 フラットボトムの 96 ウェル プレートに追加各 PO4標準の 25 μ L (0、150、300、600、1,200、および 2,400 pmol) 高低から重複する井戸で。 次に各実験サンプル (PP2A アッセイ ± シヌクレイン)、同じ 96 ウェル プレートで井戸を複製する 2.1.6 に 2.1.1 の手順で準備しての 25 μ L を追加します。 次に、標準およびサンプルをも含むそれぞれに管理作業ソリューションの 75 μ L を追加します。 10 分間室温でプレートを残します。 リン酸塩のレベルで測定可能な違いを持つサンプルの色変化を観察します。 3. 吸光光度分析 標準および吸光光度プレート リーダーを用いた波長 630 nm29に設定サンプルを含む 96 ウェル プレートを分析します。 生産吸光度曲線をプロット (サンプルを読む 630 nm) PO42,400 pmol 濃度まで直線が残ることに注意し、。

Representative Results

タンパク質の機能と活動は、リン酸化などの翻訳後修飾で変更できます。多くの蛋白質は、キナーゼによりリン酸化されるまたは、ホスファターゼによる脱燐酸化できます。場合タンパク質脱燐酸化酵素 2A (PP2A) この multisubunit ホスファターゼ リンタンパクの広い数のセリンやスレオニン残基の脱燐酸化が容易になります。異常 PP2A 活性は、過リン酸化、非同期になることがパーキンソン病を含む多くの病気で、アルツハイマー病のタウ蛋白が過リン酸化をなることができますが発生するタンパク質の機能の調節不全につながることができます。これは急速に PP2Ac 活動を評価し、異常な PP2Ac 活動が細胞機能障害につながる可能性があるかどうかを決定する社内手順を最適化するための正当化を提供します。 この無細胞比色アッセイ、無料の PO4の量を定量化することで活性を測定した PP2Ac を用いた pT 基板 (図 1 a) から切断、PO4標準曲線 (図 1 b の知られていた分からなかった量と比較).PP2Ac 活動は 0.0、0.1、0.5、1.0、および 2.0 μ M synucleins (図 1 a) への応答で (図 1 aの大きな矢印) で追加されたシヌクレインの不在でベースライン PP2Ac 活動と比較しても測定しました。 図 1: 組換え synucleins PP2A 活性化基準におけるリン酸の知られているレベルを基準にして測定されます。(A) 非同期、bSyn、および gSyn を 0 – 2 μ M タンパク質濃度、0 と比較する – の範囲で評価した 2400 pmol PO4基準。(B) A マラカイト グリーン PP2Ac 試金のための標準曲線は、実験条件で取得した値に対して計算できるリン酸の知られていた量を提供するために生成されました。PP2Ac 活動が増えるとするすべてのケース無料 PO4 pT 基板から切断の量が増加し、濃い緑の色を生成します。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。 結果を示す最初の孵化のステップで PP2Ac に synucleins の追加が無料 PO4を測定し, それにより増加の PP2Ac 活性を示すの量を増やすことができます。多くの繰り返しが 3 つすべての組換え synucleins (非同期、bSyn、gSyn) が PP2Ac アクティビティ (図 2) を大幅に高めることをショーの後の統計分析。これらが示唆された、可溶性細胞 synucleins の量の変化は、PP2Ac 活動を変更できます。ため生体のホメオスタシスを影響可能性があります。しかし、かどうか不明の PP2Ac生体内、活性化に貢献するすべての 3 synucleins が図 3のデータは PP2Ac 活動体内に貢献する、非同期の可能性が示唆しています。 図 2: PP2Ac の活動はすべての 3 つの synucleins によって刺激される。さまざまな濃度の応答の PP2Ac 活性化遺伝子組換え非同期、bSyn または gSyn のグラフィカルな表現が表示されます。すべての 3 つの遺伝子組換え synucleins PP2Ac 活動を刺激しました。ほとんどの実験で非同期は、統計解析ソフトウェアを使用して実行性全体的に著しく類似していたがわずかにより強力なように見えた。データは、4-9 の独立した実験の平均 ± SEM を表しています。ns、重要ではない;p < 0.05;p < 0.01;p < 0.0001。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。 どの synuclein(s) が脳に PP2Ac と対話できる、評価するには、co-免疫沈降 (Co IP) アッセイを野生型マウスの脳および PP2Ac 特異抗体、1 6 を使用して行った。タンパク質 SDS-PAGE によって分離し、しみされた確立された方法19を使用して gSyn、bSyn、非同期 PP2Ac のプローブします。組換えシヌクレイン コントロールは、非同期、bSyn、gSyn 抗体の特異性 (図 3 a) を示します。Co IP データでは、はるかに少ない bSyn (図 3 b)、co IP 降りてきたし、gSyn が入ってない Co IP (データは示されていない)、脳内 PP2Ac に関連付けられている主要なシヌクレインが非同期であることを明らかにします。これは、脳の PP2Ac の規制で内因性の非同期の特徴的な役割を示唆しています。それはまた bSyn 基づく療法 PP2Ac 変調では、bSyn のハイテクメソッドに知られているように、PP2A 活動 synucleinopathy とのそれらを復元する可能性がある可能性を上げるようにまだここすることができます PP2Ac30,を刺激する31。 図 3:マウス脳における内因性の synucleins と PP2Ac の相互作用します。(A) 遺伝子組換え非同期、bSyn、gSyn 以下のとおりシヌクレイン抗体をプローブしました。(B) 使用マウス抗体 1 6 Co IP を行った脳ホモジネートの immunoblots を行なったし。データのない Co-IP PP2Ac をした gSyn ではなく、非同期、PP2Ac、bSyn のとおりです。開始サンプルは PP2Ac の相対レベルを示す (1 車線)、非同期 (4 車線)、および bSyn (レーン 7) 初期のホモジュネートで。エンドのサンプル表示 PP2Ac の残りのレベル (2 車線)、非同期 (5 車線)、および bSyn (8 車線) 1 6 後ホモジュネートで PP2Ac Co IP。PP2Ac の重要なレベルが 1 6 を使用して沈澱抗体 (3 車線)、非常に小さな bSyn (レーン 9、強くかすかな bSyn 信号を矢印で表示する露出) しますが、非同期 (矢印で、6 車線) の十分な量ももたらした。* アスタリスクやしみのマーク以外の固有信号を角かっこ。抗体の使用の詳細については材料の表を参照してください。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。

Discussion

Pt このマラカイト グリーン分析は、 ³²P 標識基板を使用する古典的な方法よりも簡単だから、PP2Ac 活性を測定に使用されました。放射性試金にこの試金のもう一つの利点は、放射性同位元素はいくつかの危険性と高価なことができます、特に³²P 標識分子を短い半減期、試金の試薬の有効期限が切れる前に 1 つ実行することができます数を制限します。P 無駄にマラカイト グリーンを使用してなく、放射能も³²の処分する必要があります。マラカイト グリーンの試金は、可能な限り非選択的である基板 p-nitrophenylphosphate (同時) を使用して別の比色定量法と比較した場合にセリン/スレオニン脱燐酸化酵素の活性の測定時にも非常に敏感酵素³²の広い数によって脱燐酸化。

商業マラカイト グリーン PP2A 活性を測定するキットはいくつかの時間のために利用されているし、研究室で以前使用されました。しかし、多くのマラカイト グリーン分析の際に、このようなキットなった非常に高価。さらに、PP2A 活動の商業キット フォームを粉末試薬で利用可能なを持っていることが、わずか 1 年の安定と適切なストレージ提供時間の長い期間は構造的に安定した、容易に利用可能な分析コンポーネント。

PP2Ac 活動を刺激して、アッセイに必要な PP2Ac の量を決定してまた標準曲線 (PO₄の 150 2400 pmol のスケール上に結果のデータが残ることを確認するは、非同期を肯定的な制御として使用 bSyn と gSyn をテストする前に).それが注目される非同期 PP2Ac を刺激する場合余りに強く、反応は通常線形スケール データが消えるし、化学物質管理ソリューションを沈殿させる、リリースされた無料 PO₄プレートの正確な量を測定することは不可能リーダー。

非同期が貢献することを考える PP2Ac 活動の生体内および生体外で^{12,19,21,23,25}とすべての synucleins かなり相同性がある、それはされていたシヌクレイン家族全員が携帯無料試金で PP2Ac を刺激することができますと仮定しました。ここで説明されている比色試金を使用して、それが刺激すべての 3 synucleins が神経系と同様の機能を実行可能性があります可能性を高める PP2Ac 活動を確かに、3 つすべての組換え synucleins (非同期、bSyn、gSyn) が見つかりました。しかし、パーキンソン病から脳や認知の場合は、高度を含む組織の少ない PP2Ac 活性を持つレビー小体症集計非同期²³。Lewy ボディのような病理も展示をかくまっているマウス組織減少 PP2Ac 活動²⁵です。これは、図 3に新しいデータだけでなく、非同期ノックアウト マウス¹²から前のデータも bSyn も gSyn 通常水溶性非同期の損失を補うことがでくことを強くお勧めし、脳、またはまたそれらシヌクレイン同族体はできません。PP2Ac に示されている (図 3) として非同期として強く関連付けます。アレンの頭脳地図書は、多くの脳領域ですべて 3 シヌクレイン Mrna の共存を示しがトリプル シヌクレイン ノックアウト マウスが生成された^9,33, そのモデルの活動が評価されていない PP2Ac をされているにもかかわらずです。興味深いことに、ポロ様キナーゼ 2、による Ser129 のリン酸化は非同期 PP2Ac¹²をアクティブにすることができないが、bSyn の示す証拠提案する非常に小さな bSyn 付属として、その bSyn のリン酸化は PP2Ac の活動に影響を与える可能性があります。PP2Ac マウス脳内 (図 3)。一緒に取られて、非同期、可能性のような内因性の PP2Ac 活動変調が健康と病気に貢献することが示唆されました。

ここで説明されているプロトコルは、様々 な治療への応答でリン酸化ペプチド基質を dephosphorylate に PP2Ac の容量を決定するシンプルで強力な手法です。例えば、セラミドだけでなく、潜在的な新規治療³⁴, などの他の PP2Ac 活性剤をテストするまたは PP2Ac 阻害剤の in vitroの影響を評価するためには、これと同じ方法を使用できます。また、似たような試金が 1 6 で絶縁しています PP2Ac の活性を測定できることを指摘することが重要だ細胞抽出液や著者の^12,19,によって前述の体内組織から免疫沈降²⁵. マラカイト グリーンの試金のための将来のアプリケーションは、このような分析を使用して、ATP 活性を決定、PP2Ac 活性の測定を超えて存在します。

標準的な曲線を生成する必要が各時間毎の独立した PP2Ac の試金のために注意してください。確実に用いられるすべての試薬リン酸無料、無料の隣酸塩は人工的にバック グラウンド信号を増加し、誤った結果を生成するために必須です。アッセイの日では、すべてのサンプルを試金する十分な新鮮な管理ソリューションを準備する重要です。また、MGT のみ良い日ですが、数時間後に沈殿する傾向があります。ベンダーから購入した PP2Ac aliquotted をする必要があります、保存活動を削減凍結融解のサイクルを防ぐために受信後すぐに冷凍します。他のホスファターゼは pT 基板 (例えばPP1 と PP5³⁵) を dephosphorylate ことができる、無料のリン酸塩を削除する列にサンプルを渡す必要があります、PP2Ac が免疫沈降で孤立していない細胞や組織の抽出物を分析する場合脱燐酸化酵素の特異的阻害剤は脱燐酸化酵素特異性、前述の¹⁸の確認に使用する必要があります。

Materials

Reagent
1 M Trizma Base	Sigma-Aldrich	T15003
CaCl2 (calcium chloride)	Fisher Scientific	C70-500
Concentrated HCl	JT Baker	9535-33
Ammonium molybdate	Sigma-Aldrich	A1343
Malachite green oxalate salt	Sigma-Aldrich	M6880
Tween 20	Sigma-Aldrich	P9416
Threonine phosphopeptide (KRpTIRR)	New England peptide LLC	BP12-011
KH2PO4 (potassium phosphate)	Sigma-Aldrich	795488
Recombinant human PP2A C subunit	Cayman Chemical	10011237
Recombinant human α-synuclein	rPeptide	S-1001-2
Recombinant human β-synuclein	rPeptide	S-1003-2
Recombinant human γ-synuclein	rPeptide	S-1007-2
PP2Ac 1D6 antibody	Millipore	05-421
PP2Ac antibody 1D6	Novus Biologicals	NB100-92217
aSyn antibody C-20	Santa Cruz Biotechnology	sc-7011-R
bSyn antibody EP1537Y	Novus Biologicals	NB100-79903
gSyn antibody E-20	Santa Cruz Biotechnology	sc-10698
Zeba Spin Desalting Columns, 7K MWCO, 0.5 mL	Thermo-Fisher Scientific	89882
Name	Company	Catalog Number	Comments
Equipment/Software
Multiskan Spectrum Plate Reader	Thermo Fisher Scientific	51118650
Prism Software	GraphPad, San Diego, CA, USA
pH Meter	Fisher Scientific	13-636-AB15P