Recombinante α-β e γ-Synucleins estimular a proteína fosfatase 2A subunidade catalítica atividade ensaios em células grátis

Summary

Esta publicação apresenta um protocolo mostrando como medir a atividade da proteína recombinante fosfatase 2A catalítico o subunit (PP2Ac) em resposta a recombinante synuclein-α, β-synuclein ou proteínas γ-synuclein usando um simples ensaio colorimetric. Mostramos a conclusões a respeito da especificidade do α-synuclein para PP2Ac no cérebro de rato.

Abstract

Α-Synuclein (aSyn), β-Synuclein (bSyn) e γ-Synuclein (gSyn) são membros de uma família conservada de acompanhante, como proteínas, que são altamente expressa em tecidos neuronais vertebrados. Das três synucleins, apenas aSyn tem sido fortemente implicada em doenças neurodegenerativas como a doença de Parkinson, demência com corpos de Lewy e atrofia de sistema múltiplo. Do estudo da função normal do aSyn, os dados indicam que aSyn estimula a atividade de subunidade catalítica de uma enzima desfosforilação abundantemente expressa, PP2Ac em vitro e em vivo. Dados anteriores mostram que aSyn agregação no cérebro humano reduz a atividade PP2Ac em regiões com patologia do corpo de Lewy, onde aSyn solúvel tornou-se insolúvel. No entanto, porque todos os três synucleins ter homologia considerável nas sequências de aminoácidos, experimentos foram projetados para testar se todos podem modular a atividade PP2Ac. Usando synucleins recombinante e proteína recombinante PP2Ac, atividade foi avaliada por ensaio colorimetric verde malaquita. Dados revelaram que todos os três synucleins de recombinação estimulada PP2Ac atividade em ensaios sem célula, levantando a possibilidade que a homologia conservada entre synucleins pode dotar todos os três homologs com a capacidade de ligar e ativar o PP2Ac. Dados do co-imunoprecipitação, no entanto, sugerem que modulação PP2Ac provável ocorre por meio de interações endógenas entre aSyn e PP2Ac na vivo.

Introduction

Estudos, definindo a distribuição de synucleins no cérebro e medula espinhal mostrar que todos os três synucleins ricos em tecidos neurais, apesar de variados padrões de localização foram relataram¹. Por exemplo, aSyn é mais abundante em locais pré-sináptica do córtex cerebral e gânglios basais^2,3, bSyn tem uma distribuição mais uniforme no cérebro e medula espinhal^4,5e gSyn é mais abundante na medula espinhal e gânglios periféricos⁶. Apesar de poderem ocorrer alguma expressão embrionário de todos os synucleins, os três homologs tornam-se mais abundantes durante o período neonatal^4,5,6,7,8. Notavelmente, dados de camundongos nocaute triplo de synuclein, indicam que a perda de todos os três synucleins faz com que idade início disfunção neuronal⁹, apoiando synuclein importantes funções no sistema nervoso central (SNC)^{10, 11}. ainda não é conhecido se synuclein nocaute triplo ratos mostram alterações na distribuição de PP2Ac ou atividade. Dados de ratos do KO synuclein único revelam que a perda de aSyn sozinho é capaz de reduzir significativamente a atividade de PP2Ac no cérebro¹². Além do CNS, todas synucleins localizar para outros tecidos em todo o corpo^13,14,15.

Por causa de suas ligações genéticas bem estabelecida a neurodegeneração^16,17, aSyn está entre os melhores estudada dos três synucleins. O laboratório Perez há muito tem trabalhado para definir atividades funcionais normais, de aSyn, especialmente no CNS^{11,12,18,19,20,21, 22,23} e mais recentemente em tecidos periféricos^24,25. Entre estes, foi a descoberta que aSyn desempenha um papel fundamental de regulamentar no estimulante PP2Ac atividade¹⁹. PP2A atividade contribui amplamente para a função normal do cérebro, incluindo para a regulação da produção de dopamina²⁶. A holoenzima PP2A consiste de três subunidades independentes, a subunidade catalítica do C, PP2Ac, uma subunidade do andaime A e uma das várias subunidades B de regulamentar/segmentação diferentes que ajudam a localizar PP2A para microdomains subcellular específico, proporcionando assim PP2A diversidade funcional²⁷. Evidências mostram que as interações de aSyn com PP2Ac contribuam significativamente para a sua fosfatase atividade in vitro e in vivo^{12,19,21,23, 25}. Quando aSyn se acumula em agregados de proteínas, como faz quando Lewy corpos forma dentro neurônios de doença de Parkinson e demência com corpos de Lewy (DLB), tecidos com agregados aSyn diminuíram PP2Ac atividade^23,25, quando diminuem os níveis de aSyn solúvel. Dado que todos os três synucleins têm significativa homologia²⁸ (aSyn compartilha a identidade de 66%, com bSyn e 56%, com gSyn) e o aSyn contribui para a ativação de PP2Ac, foi hipotetisado que todos os membros da família de proteínas de synuclein podem ser capazes de aumentar a atividade de PP2Ac, pelo menos em vitro. Para avaliar isso, atividade PP2Ac foi medida em resposta a recombinação aSyn, bSyn e gSyn usando um simples ensaio colorimétrico, modelado após o método de Fernandes et al . ²⁹. este método e as romance descobertas estão detalhadas neste documento.

Protocol

1. preparação dos reagentes e Buffers Preparação do buffer de p-nitrofenil fosfato (pNPP) Prepare-se 50 mL de tampão de pNPP como segue. Base de Tris 0,30285 g pesar (consulte a Tabela de materiais) e dissolvê-lo em 25 mL de água desionizada ultrapura. Adicione 41.6 µ l de 120 mM CaCl2. Ajustar o pH 7.0 com 1 M de HCl e trazer o volume da solução final a 50 mL com água desionizada ultrapura. Certifique-se de que a concentração final é 50 mM Tris-HCl, 100 mM CaCl2, pH 7.0. Armazenar pNPP buffer no 4 oC. Para soluções de verde malaquita, prepare o seguinte. Prepare a solução A adicionando 32,8 mL de HCl concentrado a 67,2 mL de água desionizada ultrapura para criar uma solução de HCl de 4m.Nota: Solução de malaquita é preparada em uma coifa usando luvas descartáveis, máscara e óculos de segurança. Prepare a solução B , pesando 4,2 g de molibdato de amónio e adicioná-lo ao 95,8 mL da solução A. Prepare a solução C pesagem sal de oxalato verde malaquita g 0,045 e adicionando água desionizada ultrapura para trazer o volume total final a 100 mL. Prepare a solução D misturando soluções B e C, na proporção de 1:3 (v/v), agitar durante 1 h à temperatura ambiente. Filtre a Solução D uma 0,22 µm poro tamanho nitrocelulose membrana unidade de filtro utilizando uma seringa de 50 mL. Armazene a solução preparada de malaquita no 4 oC, protegido da luz. Preparação de ativador Para preparar um 1% solução de tween 20, pipeta de 10 µ l de tween 20 em 990 µ l de ultrapura água desionizada (v/v) em seguida, vórtice até o tween 20 se dissolve completamente. Preparação da solução de trabalho verde malaquita Tween 20 (MGT). Misture o ativador (etapa 1.3) com a solução de verde malaquita (solução D, passo 1.2.5) na proporção de 1: 100 (por exemplo, 1 ativador µ l de solução de verde malaquita µ l 99). Preparação de treonina Fosfopeptida (KRpTIRR) (pT) substrato. Para preparar um lugar de 2mm estoque, um frasco de Fosfopeptida 1 mg no gelo, adicione 550 µ l de água deionizada ultrapura e vórtice suavemente para dissolver. Faça ~ 10 alíquotas e armazene pT no-20oC. Preparação de synuclein Prepare-se synucleins em uma coifa usando luvas descartáveis, máscara e óculos de segurança. Resuspenda 1 mg de synuclein recombinante em água desionizada ultrapura de 1 mL para uma concentração final de 1 mg/mL. Vórtice suavemente para dissolver e colocar no gelo. Preparar 50 alíquotas µ l e armazenar no-80 oC. Elaboração de normas de fosfato Prepare a solução de reserva de fosfato 0,1 mM como segue. Pesar 0,1361 g KH2PO4 e coloque num copo com 80 mL de água desionizada ultrapura. Adicione uma barra de agitação e misture para dissolver. Transferir todos da solução para uma proveta graduada e trazer o volume total final a 100 mL com água desionizada ultrapura. Filtrar a solução através de uma 0,22 µm poro tamanho nitrocelulose membrana unidade de filtro utilizando uma seringa de 50 mL; a concentração final é de 10 mM. Diluir a solução (10 mM) 1: 100; a concentração final será de 0,1 milímetros de fosfato (PO4) deve ser usado para as normas de ensaio. Armazenar a solução estoque de fosfato no 4 oC. Consulte a tabela 1 para limitar as diluições costumávamos fazer padrões de4 PO com um volume total final de 1250 µ l cada. Adicione a quantidade apropriada de água desionizada ultrapura e fosfato para tubos de 1,5 mL, conforme tabela 1. Loja preparou padrões PO4 -20 oC. Padrões de fosfato solução de 0,1 mM PO4 (mL) 0 75 150 300 600 1.200 Ultrapura água desionizada (mL) 1.250 1.175 1.100 950 650 50 Concentração final de PO4 [pmol] 0 150 300 600 1.200 2.400 Tabela 1: Padrões de fosfato. 2. PP2A ensaio em resposta a Synucleins recombinante Nota: O volume total final para cada reação será 60 µ l, assim que o experimentador deve ajustar o volume inicial do buffer pNPP adequadamente para acomodar o volume de synucleins usado para cada amostra. Na maioria dos casos, o volume de tampão pNPP será entre 40 e 44 µ l. Prepare cada reação de PP2Ac da seguinte forma. Em um tubo de 1,5 mL, adicione 39 µ l de tampão pNPP e lugar no gelo. Adicione 1 µ l (105 ng / µ l ou 0.0007 U / µ l) de PP2Ac recombinante humana (rPP2Ac). Adicionar 4 µ l de 0, 1.5, 7.5, 15 ou 30 µM synucleins para rPP2Ac no buffer de pNPP para concentrações finais de 0, 0,1, 0,5, 1,0 e 2,0 µM e incubar a 4 ° C por 30 min em uma unidade rotativa; o volume final será 60 µ l. Depois de 30 min, mova as amostras de gelo e adicione 16 µ l de substrato de pT 2 mM. Incube a mistura de ensaio cada PP2A durante 10 minutos a 30 ° C em banho-maria com agitação intermitente. Para uma placa de 96 poços de fundo plano, adicione 25 µ l de cada PO4 padrão (0, 150, 300, 600, 1.200 e 2.400 pmol) em duplicado poços de baixa para alta. Em seguida adicione 25 µ l de cada amostra experimental (PP2A ensaio ± synuclein), preparada em etapas 2.1.1 a 2.1.6, duplicar poços na mesma placa de 96 poços. Em seguida, adicione 75 µ l da solução de trabalho de MGT a cada bem, contendo padrões e amostras. Deixe a placa à temperatura ambiente por 10 min. Observe uma cor mudar em amostras tendo diferenças mensuráveis nos níveis de fosfato. 3. análise fotométrica Analise a placa de 96 poços, contendo normas e amostras utilizando um leitor espectrofotométrico com o comprimento de onda definido como 630 nm29. Traçar a curva de absorbância produzida (amostras ler em 630 nm) e observe que continua a ser linear até 2.400 pmol concentração de PO4.

Representative Results

Atividade e função da proteína podem ser alteradas por modificações borne-translational, como fosforilação. Muitas proteínas podem ser fosforiladas por uma quinase, ou dephosphorylated por uma fosfatase. No caso de proteína fosfatase 2A (PP2A), este fosfatase multisubunit facilita a desfosforilação de resíduos de serina e treonina em um amplo número de fosfoproteínas. Atividade de PP2A anormal pode levar a desregulação da função da proteína que ocorre em muitas doenças, incluindo a doença de Parkinson onde aSyn pode tornar-se hyperphosphorylated, e na doença de Alzheimer, onde a proteína tau pode tornar-se hyperphosphorylated. Isto forneceu justificativa para otimizar um procedimento interno para rapidamente avaliar a atividade PP2Ac e determinar se a atividade anormal do PP2Ac pode levar a disfunção celular. Usando este ensaio colorimétrico sem célula, PP2Ac atividade foi medida por quantificar a quantidade de livre PO4 clivada de substrato pT (figura 1A) e em comparação com quantidades conhecidas de picomolar de PO4 na curva padrão (figura 1B ). Atividade de PP2Ac também foi medida em resposta a 0.0, 0.1, 0,5, 1,0 e 2,0 µM synucleins (figura 1A), em comparação com a atividade de PP2Ac de linha de base na ausência de synuclein adicionado (na grande seta na figura 1A). Figura 1 : PP2A ativação por synucleins recombinante, é medido em relação a conhecidos níveis de fosfato nos padrões. No(na)aSyn, bSyn e gSyn foram avaliados em uma escala de 0 – 2 µM concentrações da proteína, para comparar com 0 – 2400 pmol PO4 padrões. (B) uma curva padrão para o ensaio de PP2Ac verde malaquita foi gerada para fornecer quantidades conhecidas de fosfato, contra os quais podem ser calculados valores obtidos em condições experimentais. Em todos os casos, quando aumenta a atividade de PP2Ac, a quantidade de livre PO4 clivada de substrato pT aumenta e produz uma cor verde escura. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. Os resultados mostram que a adição de synucleins para PP2Ac na etapa de incubação inicial poderia aumentar a quantidade de livre PO4 medido, mostrando assim o aumento da atividade PP2Ac. A análise estatística, depois de muitas repetições mostram que todos os três synucleins de recombinação (aSyn, bSyn, gSyn) aumentar significativamente a atividade de PP2Ac (Figura 2). Estes resultados sugerem que alterações no montante de synucleins celular solúvel podem alterar a atividade de PP2Ac; e, portanto, podem afetar a homeostase celular. Não se sabe, no entanto, se todos os três synucleins contribuir para a ativação do PP2Ac em vivo, apesar de dados na Figura 3 sugerem que aSyn provável contribui para PP2Ac atividade na vivo. Figura 2 : PP2Ac atividade é estimulada por todos os três synucleins. Representação gráfica de PP2Ac de ativação em resposta a diferentes concentrações de recombinação aSyn, bSyn ou gSyn é mostrada. Todos os três synucleins de recombinação estimulada PP2Ac atividade. aSyn na maioria dos experimentos parecia ser um pouco mais potente, embora ANOVAs executadas usando o software estatístico foram muito semelhantes no geral. Dados representam a média ± SEM experimentos independentes de 4-9. ns, não significativo; p < 0,05; p < 0,01; p < 0,0001. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura. Para avaliar quais synuclein(s) pode interagir com PP2Ac no cérebro, co-(Co-IP) ensaios de Imunoprecipitacao foram realizados usando o cérebro de rato do tipo selvagem e o PP2Ac–anticorpo específico, 1-6. As proteínas foram então separadas por SDS-PAGE e os borrões foram vasculhados a procura de PP2Ac, aSyn, bSyn e gSyn usando métodos estabelecidos19. Synuclein recombinante controles demonstram a especificidade do anticorpo aSyn, bSyn e gSyn (Figura 3A). Co-IP dados revelam que as principal synuclein associado a PP2Ac no cérebro foi aSyn, como muito menos bSyn desceu no co-PI (Figura 3B), e não gSyn desceu no Co-PI (dados não mostrados). Isto sugere um papel distinto para aSyn endógeno no Regulamento de PP2Ac no cérebro. Também aumenta a possibilidade de que modulação de PP2Ac com bSyn-com base-terapias poderia ter potencial para restaurar a atividade PP2A naqueles com synucleinopathy, como bSyn é conhecido por ser nonamyloidogenic ainda, como mostrado aqui pode estimular PP2Ac30, 31. Figura 3: Interação do PP2Ac com synucleins endógena em cérebro de rato. (A) recombinante aSyn, bSyn e gSyn foram analisados com anticorpos específicos synuclein conforme descrito abaixo. (B) usando mouse cérebro homogenate Co-IP foi realizada com anticorpo 1 6, em seguida, as amostras foram analisadas em immunoblots. Dados são mostrados para PP2Ac, aSyn e bSyn, mas não para gSyn que fiz não Co-IP com PP2Ac. Exemplos de início mostram níveis relativos de PP2Ac (faixa 1), aSyn (faixa 4) e bSyn (faixa 7) no homogenates inicial. Amostras de fim mostram os restantes níveis de PP2Ac (pista 2), aSyn (faixa 5) e bSyn (faixa 8) em homogenates após o 6 1 PP2Ac Co-IP. Níveis significativos de PP2Ac foram immunoprecipitated usando 6 1 anticorpo (faixa 3), que também derrubou quantidades amplas de aSyn (faixa 6, na seta), mas muito pouco bSyn (faixa 9, fortemente superexposta para mostrar bSyn fraco sinal, a seta). * Asteriscos e suportes de sinais marca a não-específica em borrões. Consulte a Tabela de materiais para obter detalhes sobre anticorpos utilizados. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Discussion

Este ensaio de verde malaquita com pT foi usado para medir a atividade de PP2Ac, porque é mais fácil de realizar do que o método clássico que usa ³²P-rotulados substratos. Outra vantagem deste teste sobre ensaios radioativos é que radioisótopos representam um risco e podem ser caros, especialmente ³²P-rotulados moléculas que têm meia-vida curta, que limita o número de ensaios, um pode executar antes que expirem os reagentes. Usando o verde malaquita, ao invés de radioatividade também elimina a necessidade de dispor de ³²P perde. Ensaios de malaquita verde também são bastante sensíveis ao medir a atividade das fosfatases serina/treonina quando comparado com outro ensaio colorimétrico que utiliza o substrato p-nitrofenilfosfato (pNPP), que é não-seletivo, como pode ser dephosphorylated por um amplo número de enzimas³².

Kits comerciais malaquita verde para medir a atividade de PP2A estão disponíveis há algum tempo e foram anteriormente utilizados em laboratório. No entanto, ao fazer muitos ensaios de verde malaquita, tais jogos tornou-se proibitivamente caros. Além disso, kits comerciais para atividade de PP2A estão estáveis apenas por um ano, enquanto ter disponível em reagentes em pó forma e com armazenamento adequado, fornecem componentes de ensaio prontamente disponíveis que são estruturalmente estáveis por longos períodos de tempo.

Antes de testar a bSyn e gSyn, aSyn foi usado como controle positivo para estimular a atividade de PP2Ac e para determinar a quantidade de PP2Ac necessário para os ensaios e também para confirmar que os dados resultantes permanecem na escala com a curva padrão (150-2400 pmol de PO₄ ). Vale ressaltar que se estimula a aSyn PP2Ac também fortemente, que a reação é geralmente linear, dados apaga-se a escala e produtos químicos na solução MGT precipitam, tornando impossível para medir quantidades precisas de lançado livre-PO₄ com uma placa leitor.

Dado que o aSyn contribui para PP2Ac atividade in vivo e in vitro^{12,19,21,23,25}e que todos os synucleins homologia considerável, tinha sido a hipótese de que todos os membros da família synuclein podem ser capazes de estimular PP2Ac ensaios em células livre. Usando o ensaio colorimétrico descrito aqui, verificou-se que na verdade, todos os três synucleins de recombinação (aSyn, bSyn, gSyn) estimulada PP2Ac atividade, levantando a possibilidade que todos os três synucleins pode executar funções semelhantes no sistema nervoso. No entanto, o cérebro do mal de Parkinson ou demência com corpo de Lewy casos têm menos atividade PP2Ac em tecidos que contenham altamente agregados aSyn²³. Tecidos de mouse abrigando Lewy patologia do corpo, como também apresentam reduziram PP2Ac atividade²⁵. Isto, e novos dados na Figura 3 , bem como dados prévios de aSyn de camundongos nocaute¹², sugiro fortemente que nem bSyn nem gSyn normalmente pode compensar a perda de aSyn solúvel em cérebro, ou, alternativamente, que os homologs synuclein não podem associe com PP2Ac tão fortemente quanto aSyn como mostrada (Figura 3). O Atlas do cérebro de Allen mostra o colocalization de todos os três synuclein mRNAs em muitas áreas do cérebro, e embora ratos do KO synuclein triplo foram gerados^9,33, PP2Ac atividade não foi avaliada nesse modelo. Curiosamente, aSyn que é fosforilada na Ser129 pela quinase como Polo 2, é menos capaz de ativar o PP2Ac¹², mas evidências mostradas aqui para bSyn sugerem que a fosforilação bSyn é improvável afetar a atividade de PP2Ac, como bSyn muito pouco vieram para baixo com PP2Ac no cérebro de rato (Figura 3). Tomados em conjunto, os dados sugerem que endógenos moduladores de atividade de PP2Ac, como aSyn, provavelmente contribuem para o bem-estar e doença.

O protocolo descrito aqui é uma técnica simples contudo poderosa para determinar a capacidade de PP2Ac para dephosphorylate um substrato de Fosfopeptida em resposta a vários tratamentos. Por exemplo, esta mesma metodologia pode ser usada para testar outros ativadores de PP2Ac, como ceramidas, bem como potenciais terapêutica novela³⁴, ou para avaliar o impacto do PP2Ac inibidores em vitro. Também é importante salientar que os ensaios semelhantes podem medir a atividade de PP2Ac que tem sido isolada por 1 6 imunoprecipitação de extratos de células ou tecidos do corpo, como descritos anteriormente por autores^{12,19, 25}. aplicações do futuro para o ensaio de verde malaquita existem além de medir a atividade de PP2Ac, como atividade de ATP também pode ser determinada usando tal um ensaio.

Note que uma curva padrão deve ser gerada a cada vez para cada ensaio de PP2Ac independente. É obrigatório para garantir que todos os reagentes utilizados são fosfato livre, como livre fosfatos artificialmente aumentam o sinal de fundo e produzem resultados errôneos. No dia do ensaio é essencial para preparar bastante fresco MGT solução para todas as amostras ser analisada. Além disso, MGT só é bom no dia em que é feito e tende a precipitar-se depois de algumas horas. PP2Ac comprado de um vendedor deve ser aliquotado e armazenados congelados logo após é recebido para evitar ciclos de degelo de congelamento que reduzem a sua actividade. Como outras fosfatases podem dephosphorylate o substrato pT (por exemplo, PP1 e PP5³⁵), ao analisar extratos de célula ou tecido em que o PP2Ac não tiver sido isolada por imunoprecipitação, as amostras devem ser passadas sobre colunas para remover fosfatos livre e inibidores específicos de fosfatases devem ser usados para confirmar a especificidade de fosfatase, como descrito anteriormente,¹⁸.

Materials

Reagent
1 M Trizma Base	Sigma-Aldrich	T15003
CaCl2 (calcium chloride)	Fisher Scientific	C70-500
Concentrated HCl	JT Baker	9535-33
Ammonium molybdate	Sigma-Aldrich	A1343
Malachite green oxalate salt	Sigma-Aldrich	M6880
Tween 20	Sigma-Aldrich	P9416
Threonine phosphopeptide (KRpTIRR)	New England peptide LLC	BP12-011
KH2PO4 (potassium phosphate)	Sigma-Aldrich	795488
Recombinant human PP2A C subunit	Cayman Chemical	10011237
Recombinant human α-synuclein	rPeptide	S-1001-2
Recombinant human β-synuclein	rPeptide	S-1003-2
Recombinant human γ-synuclein	rPeptide	S-1007-2
PP2Ac 1D6 antibody	Millipore	05-421
PP2Ac antibody 1D6	Novus Biologicals	NB100-92217
aSyn antibody C-20	Santa Cruz Biotechnology	sc-7011-R
bSyn antibody EP1537Y	Novus Biologicals	NB100-79903
gSyn antibody E-20	Santa Cruz Biotechnology	sc-10698
Zeba Spin Desalting Columns, 7K MWCO, 0.5 mL	Thermo-Fisher Scientific	89882
Name	Company	Catalog Number	Comments
Equipment/Software
Multiskan Spectrum Plate Reader	Thermo Fisher Scientific	51118650
Prism Software	GraphPad, San Diego, CA, USA
pH Meter	Fisher Scientific	13-636-AB15P