यह प्रकाशन कैसे संयोजक प्रोटीन फॉस्फेट 2a उत्प्रेरक उपइकाई (PP2Ac) के जवाब में संयोजक α-synuclein, β-synuclein, या γ-synuclein प्रोटीन की गतिविधि को मापने के लिए एक सरल वर्णमिति परख का उपयोग दिखा प्रोटोकॉल प्रस्तुत करता है । हम माउस मस्तिष्क में PP2Ac की ओर α-synuclein विशिष्टता के बारे में निष्कर्षों को दिखाते हैं ।
α-Synuclein (aSyn), β-Synuclein (bSyn), और γ-Synuclein (gSyn) निगरानी के एक संरक्षित परिवार के सदस्य हैं-प्रोटीन की तरह है कि अत्यधिक हड्डीवाला न्यूरॉन ऊतकों में व्यक्त कर रहे हैं. तीन synucleins में से केवल aSyn को पार्किंसंस रोग, Lewy शरीर के साथ मनोभ्रंश, और कई प्रणाली शोष जैसे neurodegenerative विकारों में दृढ़ता से फंसाया गया है । सामान्य aSyn समारोह का अध्ययन में, डेटा संकेत मिलता है कि aSyn एक प्रचुर मात्रा में व्यक्त dephosphorylating एंजाइम की उत्प्रेरक उपइकाई की गतिविधि को उत्तेजित करता है, इन विट्रो में और vivo मेंPP2Ac. study data बताते हैं कि मानव मस्तिष्क में aSyn एकत्रीकरण Lewy शरीर विकृति वाले क्षेत्रों में PP2Ac गतिविधि को कम कर देता है, जहां घुलनशील aSyn अघुलनशील हो गया है । हालांकि, क्योंकि सभी तीन synucleins अमीनो एसिड दृश्यों में काफी समरूपता है, प्रयोगों के लिए परीक्षण डिजाइन किए गए थे अगर सब PP2Ac गतिविधि मिलाना कर सकते हैं । संयोजक synucleins और संयोजक PP2Ac प्रोटीन का प्रयोग, गतिविधि मैलाकाइट ग्रीन वर्णमिति परख द्वारा मूल्यांकन किया गया था । डेटा से पता चला है कि सभी तीन संयोजक सेल मुक्त परख में PP2Ac गतिविधि उत्तेजित synucleins, संभावना है कि संरक्षित समरूपता के बीच synucleins के लिए बांध और राज्यसत्ता को सक्रिय करने की क्षमता के साथ सभी तीन homologs हो सकता है स्थापना । immunoprecipitation डेटा, तथापि, सुझाव है कि PP2Ac मॉडुलन की संभावना vivo मेंaSyn और PP2Ac के बीच अंतर्जात बातचीत के माध्यम से होता है ।
मस्तिष्क और रीढ़ की हड्डी में synucleins के वितरण को परिभाषित अध्ययनों से पता चलता है कि सभी तीन synucleins तंत्रिका ऊतकों में समृद्ध कर रहे हैं, हालांकि स्थानीयकरण के पैटर्न अलग रिपोर्ट किया गया है1। उदाहरण के लिए, aSyn सेरेब्रल प्रांतस्था और बेसल गैंग्लिया में presynaptic साइटों पर सबसे प्रचुर मात्रा में है2,3, bSyn मस्तिष्क और रीढ़ की हड्डी में एक और अधिक समान वितरण है4,5, और gSyn रीढ़ की हड्डी में अधिक प्रचुर मात्रा में है और परिधीय गैंग्लिया6. हालांकि सभी synucleins के कुछ भ्रूण अभिव्यक्ति हो सकती है, तीन homologs नवजात अवधि के दौरान4,5,6,7,8। उल्लेखनीय है, synuclein ट्रिपल नॉकआउट चूहों से डेटा, संकेत मिलता है कि सभी तीन synucleins की हानि आयु शुरुआत न्यूरॉनिक रोग9, केंद्रीय तंत्रिका तंत्र (सीएनएस) में महत्वपूर्ण synuclein कार्यों का समर्थन10, 11. यह अभी तक अगर synuclein ट्रिपल नॉकआउट चूहों PP2Ac वितरण या गतिविधि में परिवर्तन दिखाने ज्ञात नहीं है । एकल synuclein नॉकआउट चूहों से डेटा का पता चलता है कि अकेले aSyn की हानि काफी मस्तिष्क में PP2Ac गतिविधि को कम करने में सक्षम है12. सीएनएस के अलावा, सभी synucleins शरीर में13,14,15भर में अंय ऊतकों को स्थानीयकृत ।
neurodegeneration16,17, aSyn के लिए अच्छी तरह से स्थापित आनुवंशिक लिंक की वजह से तीन synucleins का सबसे अच्छा अध्ययन के बीच है । पेरेस प्रयोगशाला लंबे समय से aSyn के सामांय कार्यात्मक गतिविधियों को परिभाषित करने के लिए काम किया है, विशेष रूप से सीएनएस11,12,18,19,20,21, 22,23 और अधिक हाल ही में परिधीय ऊतकों में24,25. इनमें से, खोज है कि aSyn PP2Ac गतिविधि उत्तेजक में एक महत्वपूर्ण नियामक भूमिका निभाता था19। PP2A गतिविधि सामान्य मस्तिष्क समारोह के लिए व्यापक रूप से योगदान देता है, डोपामाइन उत्पादन के विनियमन के लिए सहित26. PP2A holoenzyme तीन स्वतंत्र उपइकाई के होते हैं, उत्प्रेरक सी उपइकाई, PP2Ac, एक मचान एक उपइकाई, और कई अलग नियामक/लक्ष्यीकरण बी उपइकाई है कि मदद करने के लिए विशिष्ट सेलुलर microdomains को स्थानीयकृत PP2A, इस प्रकार PP2A प्रदान कार्यात्मक विविधता27। सबूत से पता चलता है कि PP2Ac के साथ aSyn बातचीत इन विट्रो में अपनी फॉस्फेट गतिविधि के लिए महत्वपूर्ण योगदान और vivo12,19,21,23, 25. जब aSyn प्रोटीन समुच्चय में जमा होता है, के रूप में यह करता है जब Lewy निकायों पार्किंसंस रोग और Lewy निकायों (DLB) के साथ मनोभ्रंश, समग्र aSyn के साथ ऊतकों के अंदर न्यूरॉन्स PP2Ac गतिविधि कम है23,25, जब घुलनशील aSyn का स्तर कम । यह देखते हुए कि सभी तीन synucleins महत्वपूर्ण है समरूपता28 (aSyn के साथ bSyn और ५६% gSyn के साथ शेयर ६६% पहचान) और है कि aSyn PP2Ac के सक्रियण के लिए योगदान देता है, यह कल्पना की थी कि synuclein प्रोटीन परिवार के सभी सदस्यों को सक्षम हो सकता है PP2Ac गतिविधि बढ़ाएं, कम-से- इन विट्रो में। इस का आकलन करने के लिए, PP2Ac गतिविधि संयोजक aSyn, bSyn के जवाब में मापा गया था, और gSyn एक सरल वर्णमिति परख का उपयोग कर, Fathi एट अल की विधि के बाद मॉडलिंग की । 29. इस विधि और उपन्यास के निष्कर्षों को विस्तृत रूप से इस के साथ समाहित कर रहे हैं ।
पीटी के साथ इस मैलाकाइट हरी परख PP2Ac गतिविधि को मापने के लिए प्रयोग किया जाता था क्योंकि यह शास्त्रीय विधि है कि ३२P-लेबलित सब्सट्रेट का उपयोग करता है से प्रदर्शन करने के लिए आसान है । रेडियोधर्मी परख पर इस परख का एक और लाभ यह है कि radioisotopes कुछ जोखिम मुद्रा और महंगा हो सकता है, विशेष रूप से ३२P-अणु है कि कम आधा रहता है, जो एक परख से पहले प्रदर्शन कर सकते है की संख्या सीमा है जीवन, reagents समाप्त हो । मैलाकाइट ग्रीन के बजाय रेडियोधर्मिता का उपयोग करना भी ३२पी अपशिष्ट के निपटान की आवश्यकता को समाप्त । मैलाकाइट हरी परख भी काफी संवेदनशील है जब serine/threonine phosphatases की गतिविधि को मापने जब एक और वर्णमिति परख कि सब्सट्रेट पी-nitrophenylphosphate (pNPP) है, जो गैर चयनात्मक है के रूप में यह हो सकता है का उपयोग करता है की तुलना में एंजाइमों की एक व्यापक संख्या के द्वारा dephosphorylated३२
वाणिज्यिक मैलाकाइट ग्रीन किट PP2A गतिविधि को मापने के लिए कुछ समय के लिए उपलब्ध किया गया है, और पहले प्रयोगशाला में इस्तेमाल किया गया । हालांकि, जब कई मैलाकाइट हरी परख कर रहे हैं, इस तरह के किट नकारात्मक महंगा हो गया । इसके अलावा, PP2A गतिविधि के लिए वाणिज्यिक किट केवल एक वर्ष के लिए स्थिर रहे हैं, जबकि पाउडर फार्म में और उचित भंडारण के साथ उपलब्ध एजेंट, आसानी से उपलब्ध परख घटक है कि समय की लंबी अवधि के लिए संरचनात्मक रूप से स्थिर है प्रदान करते हैं ।
परीक्षण bSyn और gSyn से पहले, aSyn एक सकारात्मक नियंत्रण के रूप में प्रयोग किया जाता था PP2Ac गतिविधि को उत्तेजित और PP2Ac की मात्रा निर्धारित करने के लिए परख के लिए आवश्यक है, और यह भी पुष्टि करने के लिए कि परिणामी डेटा मानक वक्र के साथ पैमाने पर रहना (१५०-पीओ के २४०० pmol4 ). यह उल्लेखनीय है कि यदि aSyn PP2Ac भी दृढ़ता से उत्तेजित करता है, हालांकि प्रतिक्रिया आम तौर पर रैखिक है, डेटा पैमाने बंद हो जाएगा और रसायनों में MGT समाधान हाला, यह असंभव को मापने के लिए सही मात्रा में जारी नि: शुल्क-PO4 एक प्लेट के साथ पाठक.
यह देखते हुए कि aSyn vivo में PP2Ac गतिविधि के लिए योगदान देता है और इन विट्रो12,19,21,23,25, और है कि सभी synucleins काफी समरूपता है, यह गया था कल्पना की है कि सभी synuclein परिवार के सदस्यों को सेल मुक्त परख में PP2Ac को उत्तेजित करने में सक्षम हो सकता है । वर्णमिति परख का उपयोग यहां वर्णित है, यह पाया गया कि वास्तव में, सभी तीन संयोजक synucleins (aSyn, bSyn, gSyn) PP2Ac गतिविधि उत्तेजित, संभावना है कि सभी तीन synucleins तंत्रिका तंत्र में समान कार्य कर सकते है स्थापना । हालांकि, Lewy शरीर के मामलों के साथ पार्किंसंस या मनोभ्रंश से मस्तिष्क, उच्च एकत्रित aSyn से युक्त ऊतकों में कम PP2Ac गतिविधि है23. माउस के ऊतकों Lewy शरीर की तरह विकृति को भी कम PP2Ac गतिविधि25प्रदर्शन । यह, और चित्रा 3 में नए डेटा के रूप में अच्छी तरह से aSyn नॉकआउट चूहों से पूर्व डेटा के रूप में12, दृढ़ता से सुझाव है कि न तो bSyn और न ही gSyn आम तौर पर मस्तिष्क में घुलनशील aSyn के नुकसान के लिए क्षतिपूर्ति कर सकते हैं, या वैकल्पिक रूप से है कि उन synuclein homologs नहीं हो सकता PP2Ac के साथ aSyn के रूप में पुरजोर रूप में दर्शाए गए अनुसार (चित्र 3) । एलन ब्रेन एटलस कई मस्तिष्क क्षेत्रों में सभी तीन synuclein mRNAs के colocalization से पता चलता है, और हालांकि ट्रिपल synuclein नॉकआउट चूहों9,३३उत्पंन किया गया है, PP2Ac गतिविधि है कि मॉडल में मूल्यांकन नहीं किया गया है । दिलचस्प है, aSyn कि कळेनासे 2 की तरह पोलो द्वारा Ser129 पर phosphorylated है, कम करने के लिए PP2Ac12सक्रिय करने में सक्षम है, लेकिन bSyn के लिए यहां दिखाया सबूत सुझाव है कि bSyn फास्फारिलीकरण प्रभाव की संभावना नहीं है PP2Ac गतिविधि, के रूप में बहुत कम bSyn के साथ नीचे आया माउस ब्रेन में PP2Ac (चित्र 3) । एक साथ लिया, डेटा सुझाव है कि अंतर्जात PP2Ac गतिविधि मॉडुलन, aSyn की तरह, की संभावना कल्याण और रोग के लिए योगदान.
यहां उल्लिखित प्रोटोकॉल एक सरल अभी तक शक्तिशाली तकनीक को PP2Ac की क्षमता का निर्धारण करने के लिए विभिंन उपचार के जवाब में एक phosphopeptide सब्सट्रेट dephosphorylate है । उदाहरण के लिए, यह एक ही पद्धति ऐसी ceramides के रूप में के रूप में अच्छी तरह से संभावित उपंयास चिकित्सीय३४, या इन विट्रो मेंPP2Ac अवरोधकों के प्रभाव का आकलन करने के रूप में अंय PP2Ac उत्प्रेरक, परीक्षण किया जा सकता है । यह भी कहना है कि इसी तरह की परख PP2Ac कि कोशिका निष्कर्षों या शरीर के ऊतकों से 1D6 immunoprecipitation द्वारा अलग किया गया है की गतिविधि उपाय कर सकते है महत्वपूर्ण है, के रूप में पहले लेखकों द्वारा वर्णित12,19, 25. मैलाकाइट ग्रीन परख के लिए भविष्य अनुप्रयोगों PP2Ac गतिविधि को मापने से परे मौजूद हैं, के रूप में एटीपी गतिविधि भी ऐसे एक परख का उपयोग कर निर्धारित किया जा सकता है ।
ध्यान दें, एक मानक वक्र प्रत्येक स्वतंत्र PP2Ac परख के लिए हर बार उत्पंन किया जाना चाहिए । यह सुनिश्चित करने के लिए अनिवार्य है कि सभी एजेंट इस्तेमाल किया फॉस्फेट मुक्त हैं, के रूप में मुक्त फॉस्फेट कृत्रिम रूप से पृष्ठभूमि संकेत बढ़ाने के लिए और गलत परिणाम का उत्पादन. परख के दिन यह सभी नमूनों के लिए पर्याप्त ताजा MGT समाधान तैयार करने के लिए आवश्यक है के लिए परख सकता है । इसके अलावा, MGT दिन है कि यह बनाया है और कुछ ही घंटों के बाद हाला करने के लिए जाता है केवल अच्छा है । PP2Ac एक विक्रेता से खरीदा aliquotted होना चाहिए और जल्द ही जम के बाद यह स्थिर गल चक्र है कि अपनी गतिविधि को कम करने को रोकने के लिए प्राप्त हुआ है जमे हुए संग्रहीत । अन्य phosphatases के रूप में पीटी सब्सट्रेट dephosphorylate कर सकते हैं (जैसे PP1 और PP5३५), जब सेल या ऊतक निष्कर्षों का विश्लेषण कर रहा है जिसमें PP2Ac immunoprecipitation द्वारा अलग नहीं किया गया है, नमूनों को मुक्त फॉस्फेट को दूर करने के लिए स्तंभों पर पारित किया जाना चाहिए और phosphatases के विशिष्ट अवरोधकों फॉस्फेट विशिष्टता की पुष्टि करने के लिए इस्तेमाल किया जाना चाहिए, के रूप में पहले18वर्णित ।
The authors have nothing to disclose.
लेखक पहले प्रयोगशाला सदस्य केंद्र Mackett, सैंड्रा कीचड़, और जिे चेन जो विधि का अनुकूलन के लिए काम द्वारा प्रयासों की सराहना करते हैं । लेखक भी स्वास्थ्य के राष्ट्रीय संस्थानों, माइकल जे फॉक्स फाउंडेशन, टेक्सास टेक विश्वविद्यालय स्वास्थ्य विज्ञान केंद्र El Paso विद्वानों गतिविधि अनुसंधान परियोजना (सर्प), Lizanell और Colbert Coldwell फाउंडेशन, एकाधिक प्रणाली शोष गठबंधन धंयवाद, परिवार अनुसंधान लादने, और इस अनुसंधान के वित्तीय सहायता के लिए अंना मॅई डॉयल उपहार कोष ।
Reagent | |||
1 M Trizma Base | Sigma-Aldrich | T15003 | |
CaCl2 (calcium chloride) | Fisher Scientific | C70-500 | |
Concentrated HCl | JT Baker | 9535-33 | |
Ammonium molybdate | Sigma-Aldrich | A1343 | |
Malachite green oxalate salt | Sigma-Aldrich | M6880 | |
Tween 20 | Sigma-Aldrich | P9416 | |
Threonine phosphopeptide (KRpTIRR) | New England peptide LLC | BP12-011 | |
KH2PO4 (potassium phosphate) | Sigma-Aldrich | 795488 | |
Recombinant human PP2A C subunit | Cayman Chemical | 10011237 | |
Recombinant human α-synuclein | rPeptide | S-1001-2 | |
Recombinant human β-synuclein | rPeptide | S-1003-2 | |
Recombinant human γ-synuclein | rPeptide | S-1007-2 | |
PP2Ac 1D6 antibody | Millipore | 05-421 | |
PP2Ac antibody 1D6 | Novus Biologicals | NB100-92217 | |
aSyn antibody C-20 | Santa Cruz Biotechnology | sc-7011-R | |
bSyn antibody EP1537Y | Novus Biologicals | NB100-79903 | |
gSyn antibody E-20 | Santa Cruz Biotechnology | sc-10698 | |
Zeba Spin Desalting Columns, 7K MWCO, 0.5 mL | Thermo-Fisher Scientific | 89882 | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Equipment/Software | |||
Multiskan Spectrum Plate Reader | Thermo Fisher Scientific | 51118650 | |
Prism Software | GraphPad, San Diego, CA, USA | ||
pH Meter | Fisher Scientific | 13-636-AB15P |