בידוד של נגזרות רקמה שומנית Murine כלי דם שבר כיחידות כלי דם של הנדסת רקמות
Summary
אנו מציגים פרוטוקול לבודד שברי כלי דם ברקמה שומני נגזרות המייצגים יחידות כלי דם הבטיח. הם יכולים להיות מבודדים במהירות, אינו דורש עיבוד במבחנה, ובכך, ניתן להשתמש prevascularization צעד אחד בתחומים שונים של הנדסת רקמות.
Abstract
רשת כלי דם פונקציונלית היא בעל חשיבות המרכזית להישרדות והאינטגרציה של מבני רקמות מהונדסים. לשם כך, מספר אסטרטגיות אנגיוגנזה ו prevascularization הוקמו. עם זאת, רוב הגישות מבוססות תאים כוללות גוזלת זמן במבחנת צעדים ליצירת רשת כלי דם. לפיכך, הם אינם מתאימים נהלי צעד אחד תוך ניתוחיים. רקמת שומן הנגזרת שברי כלי דם (ad-MVF) מייצג יחידות כלי דם הבטיח. הם יכולים להיות בקלות לבודד מרקמות שומן ולהציג מורפולוגיה microvessel פונקציונלית. יתר על כן, הם להרכיב מחדש במהירות לתוך רשתות כלי דם חדשות לאחר השתלת in vivo. בנוסף, אד-MVF הוכח לגרום lymphangiogenesis. לבסוף, הם מקור עשיר של תאי גזע mesenchymal, אשר עשוי לתרום לפוטנציאל כלי הדם הגבוה שלהם. במחקרים קודמים אנו הדגמנו את vascularizati המדהיםעל יכולת של MVF מודעת תחליפי עצם ועור מהונדסים. במחקר הנוכחי, אנו מדווחים על פרוטוקול סטנדרטי עבור הבידוד אנזימטי של אד-MVF מרקמות שומן בעכברים.
Introduction
הנדסת רקמות מתמקדת הייצור של תחליפי רקמה ואיבר מקיימים, לשחזר או להגדיל את הפונקציה של שמיש ב עמיתיהם vivo 1, 2. גורלם של מבני רקמות מהונדסים תלוי באופן מכריע על כלי דם הולם 3. רשתות כלי דם בתוך המבנים האלה צריכים להיות מאורגנים באופן היררכי עם arterioles, נימים, ו venules לאפשר טפטוף דם יעיל אחרי inosculation אל כלי הדם של הנמען 4. הדור של רשתות כאלה הוא בין האתגרים המרכזיים בתחום הנדסת רקמות. לשם כך, קשת רחבה של אסטרטגיות כלי דם ניסיוני כבר הציגה במהלך שני העשורים האחרונים 5, 6.
גישות אנגיוגנזה לעורר את ingrowth של microvessels הנמען Tiss מהונדסיםUES באמצעות שינוי פיגום מבני או physicochemical, כגון השילוב של צמיחת גורמי 7. עם זאת, עבור כלי דם של המבנים התלת-ממדי גדול, אסטרטגיות תלויי אנגיוגנזה מוגבלים במידה ניכרת בשיעורי צמיחה איטית של פיתוח microvessels 8.
לעומת זאת, מושג prevascularization שואף עבור הדור של רשתות כלי דם פונקציונליות בתוך רקמת הבונה לפני ההשתלה שלהם 9. Prevascularization הקונבנציונלי כרוך לתרבות המשותפת של תאים מייצרי כלי, כגון תאי אנדותל, תאי ציור קיר או תאי גזע 10, בתוך פיגומים. לאחר היווצרות רשת כלי דם, מבני prevascularized לאחר מכן ניתן מושתלים לתוך פגמים ברקמות. ראוי לציון, גישת prevascularization זה קשה ליישם במסגרת רפואית, משום שהיא מבוססת על קומפלקס זמן רב במבחנה </ em> נהלים, אשר מוגבלים על ידי מכשולים רגולטוריים מרכזיים 9. בהתאם לכך, יש עדיין צורך לפיתוח אסטרטגיות prevascularization רומן כי הם יותר מתאימים יישום קליני רחב.
אסטרטגיה כזו prevascularization עשויה להיות היישום של שברי כלי דם נגזר רקמה שומני (ad-MVF). אד-MVF מייצג יחידות של כלי דם חזקים כי ניתן לקצור בכמויות גדולות מרקמת השומן של חולדות 11, 12 ו עכברים 13. הם מורכבים arteriolar, נימים, ומגזרי כלי venular, אשר מציגים מורפולוגיה microvessel פיזיולוגית עם לומן ותאי perivascular ייצוב 14, 15. תכונה ייחודית זו מאפשרת ההשתלה המיידית של פיגומי אד-MVF זרע לתוך פגמי רקמות ללא precultivation. יש, במודעה-MVF במהירות להרכיב מחדש בלרשתות כלי דם פונקציונליות. יתר על כן, אד-MVF מייצג מקור עשיר של תאי גזע mesenchymal 16, אשר עשוי גם לתרום יכולת ההתחדשות הבולטת שלהם. בהתאם לכך, אד-MVF משמש יותר ויותר בתחומים שונים של הנדסת רקמות 14, 15, 17, 18, 19, 20, 21.
בידודו של אד-MVF כבר נקבע במקור בחולדות 11, 12. בזאת, אנו מתארים פרוטוקול, אשר מאפשר בידוד הסטנדרטי של MVF מודעה בעכברים מן רפידות שומן epididymal. זה עשוי לספק תובנות נוספות המנגנונים המולקולריים שבבסיס פונקציה אד-MVF באמצעות מודלים עכבר מהונדס.
Protocol
Representative Results
Discussion
במחקר זה אנו מציגים פרוטוקול ומבוסס על הבידוד של אד-MVF. קבלת פרסומות MVF מרקמות שומן בעכברים היא הליך פשוט עם כמה צעדים קריטיים. עכברים להפגין תת עורית שונה ופיקדונות שומן intraabdominal. כפי שתואר לעיל עבור חולדות, מקור שומן המתאים ביותר עבור בידוד של אד-MVF הם רפידות שומן epididyma…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
אנו מודים על הסיוע הטכני המצוין של ג'נין Becker, קרוליין Bickelmann ורות ניקלס. מחקר זה מומן על ידי מענק של (DFG – קרן המחקר הגרמנית) – LA 2682 / 7-1.
Materials
| 1.5-mL conical microcentrifuge tube | VWR, Kelsterbach, Germany | 700-5239 | |
| 100-µL precision pipette | Eppendorf, Hamburg, Germany | 4920000059 | |
| 10-mL measuring pipette | Costar, Corning Inc., New York, USA | 4488 | |
| 14-mL PP tubes | Greiner bio-one, Frickenhausen, Germany | 187261 | |
| 1-mL precision pipette | Eppendorf, Hamburg, Germany | 4920000083 | |
| 500-µm filter (pluriStrainer 500 µm) | HISS Diagnostics, Freiburg, Germany | 43-50500-03 | |
| 50-mL conical centrifuge tube | Greiner bio-one, Frickenhausen, Germany | 227261 | |
| 50-mL Erlenmeyer flask | VWR, Kelsterbach, Germany | 214-0211 | |
| 96-well plate | Greiner bio-one, Frickenhausen, Germany | 65518 | |
| cell detachment solution (Accutase) | eBioscience, San Diego, CA USA | 00-4555-56 | |
| C57BL/6 mice | Charles River, Cologne, Germany | 027 | |
| C57BL/6-Tg(CAG-EGFP)1Osb/J mice | The Jackson Laboratory, Bar Harbor, USA | 003291 | |
| CD117-FITC | BD Biosciences, Heidelberg, Germany | 553373 | |
| CD31-PE | BD Biosciences, Heidelberg, Germany | 553354 | |
| Collagenase NB4G | Serva Electrophoresis GmbH, Heidelberg, Germany | 17465.02 | Lot tested by manufacturer for enzymatic activity |
| Dissection scissors | Braun Aesculap AG &CoKG, Melsungen, Germany | BC 601 | |
| DNA-binding dye (Bisbenzimide H33342) | Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Germany | B2261 | |
| Dulbecco's modified Eagle medium (DMEM) | PAN Biotech, Rickenbach, Germany | P04-03600 | |
| Fetal calf serum (FCS) | Biochrom GmbH, Berlin, Germany | S0615 | |
| Fine forceps | S&T AG, Neuhausen, Switzerland | FRS-15 RM-8 | |
| Fine scissors | World Precision Instrumets, Sarasota, FL, USA | 503261 | |
| Dermal skin substitute (Integra) | Integra Life Sciences, Sain Priest, France | 62021 | |
| Ketamine | Serumwerk Bernburg AG, Bernburg, Germany | 7005294 | |
| M-IgG2akAL488 | eBioscience, San Diego, CA USA | 53-4724-80 | |
| Octeniderm (disinfecting solution) | Schülke & Mayer, Norderstedt, Germany | 118211 | |
| Penicillin/Streptomycin | Biochrom, Berlin, Germany | A2213 | |
| Petri dish | Greiner bio-one, Frickenhausen, Germany | 664160 | |
| Phosphate-buffered saline (PBS) | Lonza Group, Basel, Switzerland | 17-516F | |
| pluriStrainer 20-µm (20 µm filter) | HISS Diagnostics, Freiburg, Germany | 43-50020-03 | |
| Rat-IgG2akFITC | BD Biosciences, Heidelberg, Germany | 553988 | |
| Rat-IgG2akPE | BD Biosciences, Heidelberg, Germany | 553930 | |
| Small preparation scissors | S&T AG, Neuhausen, Switzerland | SDC-15 R-8S | |
| Surgical forceps | Braun Aesculap AG &CoKG, Melsungen, Germany | BD510R | |
| Tape (Heftpflaster Seide) 1.25 cm | Fink & Walter GmbH, Mechweiler, Germany | 1671801 | |
| Xylazine | Bayer Vital GmbH, Leverkusen, Germany | 1320422 | |
| α-SMA-AL488 | eBioscience, San Diego, CA USA | 53-9760-82 | Intracellular labeling additionally requires Cytofix/Cytoperm (BD Biosciences, Heidelberg, Germany; #554722) |
References
- Langer, R., Vacanti, J. P. Tissue engineering. Science. 260 (5110), 920-926 (1993).
- Khademhosseini, A., Langer, R. A decade of progress in tissue engineering. Nat Protoc. 11 (10), 1775-1781 (2016).
- Novosel, E. C., Kleinhans, C., Kluger, P. J. Vascularization is the key challenge in tissue engineering. Adv Drug Deliv Rev. 63 (4-5), 300-311 (2011).
- Rouwkema, J., Khademhosseini, A. Vascularization and Angiogenesis in Tissue Engineering: Beyond Creating Static Networks. Trends Biotechnol. 34 (9), 733-745 (2016).
- Laschke, M. W., Menger, M. D. Vascularization in tissue engineering: angiogenesis versus inosculation. Eur Surg Res. 48 (2), 85-92 (2012).
- Sarker, M., Chen, X. B., Schreyer, D. J. Experimental approaches to vascularisation within tissue engineering constructs. J Biomater Sci Polym Ed. 26 (12), 683-734 (2015).
- Frueh, F. S., Menger, M. D., Lindenblatt, N., Giovanoli, P., Laschke, M. W. Current and emerging vascularization strategies in skin tissue engineering. Crit Rev Biotechnol. 20, 1-13 (2016).
- Utzinger, U., Baggett, B., Weiss, J. A., Hoying, J. B., Edgar, L. T. Large-scale time series microscopy of neovessel growth during angiogenesis. Angiogenesis. 18 (3), 219-232 (2015).
- Laschke, M. W., Menger, M. D. Prevascularization in tissue engineering: Current concepts and future directions. Biotechnol Adv. 34 (2), 112-121 (2016).
- Baiguera, S., Ribatti, D. Endothelialization approaches for viable engineered tissues. Angiogenesis. 16 (1), 1-14 (2013).
- Wagner, R. C., Kreiner, P., Barrnett, R. J., Bitensky, M. W. Biochemical characterization and cytochemical localization of a catecholamine-sensitive adenylate cyclase in isolated capillary endothelium. Proc Natl Acad Sci U S A. 69 (11), 3175-3179 (1972).
- Wagner, R. C., Matthews, M. A. The isolation and culture of capillary endothelium from epididymal fat. Microvasc Res. 10 (3), 286-297 (1975).
- Laschke, M. W., Menger, M. D. Adipose tissue-derived microvascular fragments: natural vascularization units for regenerative medicine. Trends Biotechnol. 33 (8), 442-448 (2015).
- Laschke, M. W., et al. Vascularisation of porous scaffolds is improved by incorporation of adipose tissue-derived microvascular fragments. Eur Cell Mater. 24, 266-277 (2012).
- Frueh, F. S., et al. Adipose tissue-derived microvascular fragments improve vascularization, lymphangiogenesis and integration of dermal skin substitutes. J Invest Dermatol. 137 (1), 217-227 (2017).
- McDaniel, J. S., Pilia, M., Ward, C. L., Pollot, B. E., Rathbone, C. R. Characterization and multilineage potential of cells derived from isolated microvascular fragments. J Surg Res. 192 (1), 214-222 (2014).
- Nakano, M., et al. Effect of autotransplantation of microvessel fragments on experimental random-pattern flaps in the rat. Eur Surg Res. 30 (3), 149-160 (1998).
- Nakano, M., et al. Successful autotransplantation of microvessel fragments into the rat heart. Eur Surg Res. 31 (3), 240-248 (1999).
- Shepherd, B. R., Hoying, J. B., Williams, S. K. Microvascular transplantation after acute myocardial infarction. Tissue Eng. 13 (12), 2871-2879 (2007).
- Pilia, M., et al. Transplantation and perfusion of microvascular fragments in a rodent model of volumetric muscle loss injury. Eur Cell Mater. 28, 11-23 (2014).
- Laschke, M. W., et al. Adipose tissue-derived microvascular fragments from aged donors exhibit an impaired vascularisation capacity. Eur Cell Mater. 28, 287-298 (2015).
- Okabe, M., Ikawa, M., Kominami, K., Nakanishi, T., Nishimune, Y. ‘Green mice’ as a source of ubiquitous green cells. FEBS Lett. 407 (3), 313-319 (1997).
- Honek, J., et al. Modulation of age-related insulin sensitivity by VEGF-dependent vascular plasticity in adipose tissues. Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (41), 14906-14911 (2014).
- Cho, C. H., et al. Angiogenic role of LYVE-1-positive macrophages in adipose tissue. Circ Res. 100 (4), e47-e57 (2007).
- Han, S., Sun, H. M., Hwang, K. C., Kim, S. W. Adipose-Derived Stromal Vascular Fraction Cells: Update on Clinical Utility and Efficacy. Crit Rev Eukaryot Gene Expr. 25 (2), 145-152 (2015).
- Chen, Y. J., et al. Isolation and Differentiation of Adipose-Derived Stem Cells from Porcine Subcutaneous Adipose Tissues. J Vis Exp. (109), e53886 (2016).
- Guillaume-Jugnot, P., et al. Autologous adipose-derived stromal vascular fraction in patients with systemic sclerosis: 12-month follow-up. Rheumatology (Oxford). 55 (2), 301-306 (2016).
- Tissiani, L. A., Alonso, N. A Prospective and Controlled Clinical Trial on Stromal Vascular Fraction Enriched Fat Grafts in Secondary Breast Reconstruction. Stem Cells Int. , 2636454 (2016).
- Calcagni, M., et al. The novel treatment of SVF-enriched fat grafting for painful end-neuromas of superficial radial nerve. Microsurgery. , (2016).
- Hoying, J. B., Boswell, C. A., Williams, S. K. Angiogenic potential of microvessel fragments established in three-dimensional collagen gels. In Vitro Cell Dev Biol Anim. 32 (7), 409-419 (1996).
- Kirkpatrick, N. D., Andreou, S., Hoying, J. B., Utzinger, U. Live imaging of collagen remodeling during angiogenesis. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 292 (6), H3198-H3206 (2007).
