Vi presentiamo un protocollo per isolare frammenti adiposo microvascolari derivate dal tessuto che rappresentano le unità di vascolarizzazione promettenti. Possono essere isolati rapidamente, non richiedono l'elaborazione in vitro e, pertanto, può essere utilizzato per un passo prevascularization in diversi campi dell'ingegneria dei tessuti.
Una rete microvascolare funzionale è di importanza fondamentale per la sopravvivenza e l'integrazione dei costrutti ingegneria tessutale. A questo scopo, sono state stabilite diverse strategie angiogenici e prevascularization. Tuttavia, la maggior parte degli approcci basati su celle includono passi in termini di tempo in vitro per la formazione di una rete microvascolare. Quindi, essi non sono adatti per intraoperatori procedure one-step. Adiposo derivate dal tessuto frammenti microvascolari (ad-MVF) rappresentano le unità vascolarizzazione promettenti. Essi possono essere facilmente isolati dal tessuto grasso e presentano una morfologia microvasi funzionale. Inoltre, essi rapidamente rimontare in nuove reti microvascolari dopo l'impianto in vivo. Inoltre, ad-DMV hanno dimostrato di indurre linfangiogenesi. Infine, sono una ricca fonte di cellule staminali mesenchimali, che possono ulteriormente contribuire alla loro elevato potenziale di vascolarizzazione. In studi precedenti abbiamo dimostrato la notevole vascularizatisulla capacità di ad-MVF in sostituti ossei e cutanei ingegnerizzati. Nel presente studio, riportiamo un protocollo standardizzato per l'isolamento enzimatica di ad-DMV da tessuto adiposo murino.
Ingegneria tissutale si concentra sulla fabbricazione di tessuti e organi succedanei mantenere, ripristinare o aumentare la funzione di inutilizzabile in vivo controparti 1, 2. Il destino di costrutti di tessuto ingegnerizzati dipende essenzialmente una vascolarizzazione adeguata 3. Reti microvascolari all'interno di questi costrutti dovrebbero essere organizzati gerarchicamente con arteriole, capillari e venule per consentire efficiente perfusione sanguigna dopo inosculation alla vascolarizzazione del destinatario 4. La generazione di queste reti è tra le principali sfide nel campo dell'ingegneria dei tessuti. A tale scopo, un ampio spettro di strategie di vascolarizzazione sperimentali è stata introdotta nel corso degli ultimi due decenni 5, 6.
approcci angiogenici stimolano la crescita interna dei microvasi dei destinatari nel tiss ingegnerizzatiues mediante modificazione ponteggio strutturale o fisico-chimiche, come ad esempio l'incorporazione di fattori di crescita 7. Tuttavia, per la vascolarizzazione di grandi costrutti tridimensionali, le strategie di angiogenesi-dipendenti sono notevolmente limitate da tassi di crescita lenta di sviluppo di microvasi 8.
Al contrario, il concetto di prevascularization mira per la generazione di reti microvascolari funzionali all'interno del tessuto costruisce prima del loro impianto 9. Prevascularization convenzionale comporta la co-coltura delle cellule del vaso che formano, come le cellule endoteliali, cellule murali o cellule staminali 10, all'interno ponteggi. Dopo la formazione della rete microvascolare, i costrutti prevascularized possono essere impiantati in difetti del tessuto. Degno di nota, questo approccio prevascularization è di difficile applicazione in un ambiente clinico, perché si basa sulla complessa e richiede molto tempo in vitro </ em> le procedure, che sono limitati dai maggiori ostacoli normativi 9. Di conseguenza, v'è ancora una necessità per lo sviluppo di strategie prevascularization nuovi che sono più adatti per un'ampia applicazione clinica.
Tale strategia prevascularization può essere l'applicazione di frammenti di tessuto adiposo derivate microvascolari (ad-MVF). ad-MVF rappresentano le unità di vascolarizzazione potenti che possono essere raccolti in grandi quantità dal tessuto adiposo dei ratti 11, 12 e 13 topi. Sono costituiti da arteriolare, capillare e segmenti di flotta venulari, che presentano una morfologia microrecipiente fisiologico con un lume e stabilizzanti cellule perivascolari 14, 15. Questa caratteristica unica permette l'inserimento immediato di ponteggi ad-MVF-seminato in difetti del tessuto, senza precoltura. C'è, l'annuncio-DMV rapidamente rimontare inalle reti microvascolari funzionali. Inoltre, ad-DMV rappresentano una ricca fonte di cellule staminali mesenchimali 16, che possono inoltre contribuire alla loro capacità rigenerativa sorprendente. Di conseguenza, ad-DMV sono sempre più utilizzati in diversi campi dell'ingegneria dei tessuti 14, 15, 17, 18, 19, 20, 21.
L'isolamento di ad-DMV è stato originariamente istituito nel ratti 11, 12. Qui, descriviamo un protocollo, che permette l'isolamento standardizzato di murino ad-DMV da cuscinetti di grasso dell'epididimo. Ciò può fornire ulteriori informazioni sui meccanismi molecolari alla base della funzione ad-DMV utilizzando modelli di topi transgenici.
In questo studio vi presentiamo un protocollo consolidata per l'isolamento di ad-MVF. Ottenere ad-MVF dal tessuto adiposo murino è una procedura semplice con pochi passaggi critici. I topi mostrano sottocutaneo diverso e depositi di grasso intra-addominale. Come precedentemente descritto per ratti, la fonte di grassi più adatto per l'isolamento di annuncio-DMV sono i cuscinetti adiposi dell'epididimo causa delle loro dimensioni, struttura omogenea e poco contaminate con vasi sanguigni più grandi <sup clas…
The authors have nothing to disclose.
Siamo grati per l'eccellente assistenza tecnica di Janine Becker, Caroline Bickelmann e Ruth Nickels. Questo studio è stato finanziato da una sovvenzione della Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG – German Research Foundation) – LA 2682 / 7-1.
1.5-mL conical microcentrifuge tube | VWR, Kelsterbach, Germany | 700-5239 | |
100-µL precision pipette | Eppendorf, Hamburg, Germany | 4920000059 | |
10-mL measuring pipette | Costar, Corning Inc., New York, USA | 4488 | |
14-mL PP tubes | Greiner bio-one, Frickenhausen, Germany | 187261 | |
1-mL precision pipette | Eppendorf, Hamburg, Germany | 4920000083 | |
500-µm filter (pluriStrainer 500 µm) | HISS Diagnostics, Freiburg, Germany | 43-50500-03 | |
50-mL conical centrifuge tube | Greiner bio-one, Frickenhausen, Germany | 227261 | |
50-mL Erlenmeyer flask | VWR, Kelsterbach, Germany | 214-0211 | |
96-well plate | Greiner bio-one, Frickenhausen, Germany | 65518 | |
cell detachment solution (Accutase) | eBioscience, San Diego, CA USA | 00-4555-56 | |
C57BL/6 mice | Charles River, Cologne, Germany | 027 | |
C57BL/6-Tg(CAG-EGFP)1Osb/J mice | The Jackson Laboratory, Bar Harbor, USA | 003291 | |
CD117-FITC | BD Biosciences, Heidelberg, Germany | 553373 | |
CD31-PE | BD Biosciences, Heidelberg, Germany | 553354 | |
Collagenase NB4G | Serva Electrophoresis GmbH, Heidelberg, Germany | 17465.02 | Lot tested by manufacturer for enzymatic activity |
Dissection scissors | Braun Aesculap AG &CoKG, Melsungen, Germany | BC 601 | |
DNA-binding dye (Bisbenzimide H33342) | Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Germany | B2261 | |
Dulbecco's modified Eagle medium (DMEM) | PAN Biotech, Rickenbach, Germany | P04-03600 | |
Fetal calf serum (FCS) | Biochrom GmbH, Berlin, Germany | S0615 | |
Fine forceps | S&T AG, Neuhausen, Switzerland | FRS-15 RM-8 | |
Fine scissors | World Precision Instrumets, Sarasota, FL, USA | 503261 | |
Dermal skin substitute (Integra) | Integra Life Sciences, Sain Priest, France | 62021 | |
Ketamine | Serumwerk Bernburg AG, Bernburg, Germany | 7005294 | |
M-IgG2akAL488 | eBioscience, San Diego, CA USA | 53-4724-80 | |
Octeniderm (disinfecting solution) | Schülke & Mayer, Norderstedt, Germany | 118211 | |
Penicillin/Streptomycin | Biochrom, Berlin, Germany | A2213 | |
Petri dish | Greiner bio-one, Frickenhausen, Germany | 664160 | |
Phosphate-buffered saline (PBS) | Lonza Group, Basel, Switzerland | 17-516F | |
pluriStrainer 20-µm (20 µm filter) | HISS Diagnostics, Freiburg, Germany | 43-50020-03 | |
Rat-IgG2akFITC | BD Biosciences, Heidelberg, Germany | 553988 | |
Rat-IgG2akPE | BD Biosciences, Heidelberg, Germany | 553930 | |
Small preparation scissors | S&T AG, Neuhausen, Switzerland | SDC-15 R-8S | |
Surgical forceps | Braun Aesculap AG &CoKG, Melsungen, Germany | BD510R | |
Tape (Heftpflaster Seide) 1.25 cm | Fink & Walter GmbH, Mechweiler, Germany | 1671801 | |
Xylazine | Bayer Vital GmbH, Leverkusen, Germany | 1320422 | |
α-SMA-AL488 | eBioscience, San Diego, CA USA | 53-9760-82 | Intracellular labeling additionally requires Cytofix/Cytoperm (BD Biosciences, Heidelberg, Germany; #554722) |