Isolement des murins dérivés tissu adipeux microvasculaire fragments comme Vascularization unités pour l'ingénierie tissulaire

Summary

Nous présentons un protocole pour isoler des fragments microvasculaires du tissu adipeux dérivé qui représentent des unités de vascularisation prometteuses. Ils peuvent être isolés rapidement, ne nécessitent pas dans le traitement in vitro et, par conséquent, peut être utilisé pour prévascularisation une étape dans différents domaines de l' ingénierie tissulaire.

Abstract

Un réseau microvasculaire fonctionnelle est d'une importance cruciale pour la survie et l'intégration des constructions de tissu d'ingénierie. A cet effet, plusieurs stratégies angiogéniques et prévascularisation ont été mis en place. Cependant, la plupart des approches basées sur les cellules comprennent chronophages étapes in vitro pour la formation d'un réseau microvasculaire. , Ils ne sont donc pas adaptés pour peropératoires procédures en une seule étape. fragments microvasculaires adipeuses dérivées de tissu (ad MVF) représentent des unités de vascularisation prometteuses. Ils peuvent facilement être isolées à partir de tissu adipeux et présentent une morphologie fonctionnelle microvaisseaux. De plus, ils réassembler rapidement dans de nouveaux réseaux microvasculaires après l' implantation in vivo. En outre, ad-MVF ont été montré pour induire lymphangiogenèse. Enfin, ils sont une riche source de cellules souches mésenchymateuses, qui peut en outre contribuer à leur fort potentiel de vascularisation. Dans des études précédentes, nous avons démontré la vascularizati remarquablesur la capacité d'ad-MVF dans l'os d'ingénierie et de substituts cutanés. Dans la présente étude, nous présentons un protocole standardisé pour l'isolement enzymatique ad-MVF de tissu adipeux de souris.

Introduction

L' ingénierie tissulaire se concentre sur la fabrication de produits de remplacement de tissus et d' organes qui maintenir, rétablir ou d' augmenter la fonction des inopérable homologues in vivo ^{1, 2.} Le sort des constructions de l' ingénierie tissulaire dépend essentiellement d' une vascularisation adéquate ^3. Réseaux microvasculaires au sein de ces constructions doivent être organisés hiérarchiquement avec artérioles, capillaires et veinules pour permettre la perfusion sanguine efficace après anastomose à la vasculature du bénéficiaire ^4. La génération de ces réseaux est parmi les principaux défis dans l'ingénierie tissulaire. A cet effet, un large éventail de stratégies de revascularisation expérimentales a été mis en place au cours des deux dernières décennies , ^{5, 6.}

approches angiogéniques stimulent la croissance interne des microvaisseaux bénéficiaires dans Tiss d'ingénierieues par des moyens de modification de structure d'échafaudage ou physico – chimique, telles que l'incorporation de facteurs de croissance ^7. Toutefois, pour les grandes constructions de vascularisation en trois dimensions, des stratégies dépendant de l' angiogenèse sont nettement limités par des taux de croissance lente de développement microvaisseaux ^8.

Au contraire, le concept de prévascularisation vise pour la génération des réseaux microvasculaires fonctionnelles au sein des constructions de tissus avant leur implantation ^9. Prévascularisation classique implique la co-culture de cellules de formation de vaisseaux, comme les cellules endothéliales, les cellules murales ou des cellules souches ^10, à l' intérieur des échafaudages. Après la formation du réseau microvasculaire, les constructions prévascularisées peuvent alors être implantés dans des défauts du tissu. Il convient de noter, cette approche prévascularisation est difficile à appliquer dans un contexte clinique, car elle est basée sur in vitro complexe et prend du temps </ em> procédures, qui sont limitées par les principaux obstacles réglementaires ^9. Par conséquent, il y a encore un besoin pour le développement de nouvelles stratégies de prévascularisation qui sont plus appropriés pour une large application clinique.

Une telle stratégie de prévascularisation peut être l'application des dérivées de tissu adipeux fragments microvasculaires (ad-MVF). ad-MVF représentent des unités de vascularisation puissants qui peuvent être récoltées en grandes quantités dans le tissu adipeux des rats ^{11, 12} et ¹³ les souris. Ils se composent d'artérioles, capillaires et veinules segments de vaisseaux, qui présentent une morphologie de microvaisseaux physiologique avec une lumière et de stabilisation des cellules périvasculaires ^{14, 15.} Cette caractéristique unique permet l'implantation immédiate des échafauds ad MVF tête de série dans les défauts des tissus sans préculture. Là-bas, l'annonce-MVF réassembler rapidementà des réseaux microvasculaires fonctionnelles. Par ailleurs, ad-MVF représentent une riche source de cellules souches mésenchymateuses ^16, ce qui peut contribuer en outre à leur capacité de régénération frappant. Par conséquent, ad-MVF sont de plus en plus utilisé dans différents domaines de l' ingénierie tissulaire ^{14, 15, 17, 18, 19, 20, 21.}

L'isolement de l' ad-MVF a été initialement mis en place chez les rats ^{11, 12.} Nous décrivons ici un protocole qui permet l'isolement normalisé ad-MVF de souris à partir de tampons de graisse épididyme. Cela peut fournir de nouvelles informations sur les mécanismes moléculaires sous-jacents fonction ad-MVF en utilisant des modèles de souris transgéniques.

Protocol

Toutes les procédures ont été effectuées selon l'Institut national des directives de santé pour l'utilisation des animaux de laboratoire et ont suivi les directives institutionnelles (Landesamt für Soziales, Gesundheit und Verbraucherschutz, Abt. Lebensmittel- und Veterinärwesen, Zentralstelle, Sarrebruck, Allemagne). 1. Préparation des instruments chirurgicaux Tenir prêt les ciseaux de dissection, des pinces chirurgicales, des petits ciseaux de préparation, une …

Representative Results

Dans la présente étude, nous avons effectué six procédures d'isolement ad MVF avec le tissu adipeux de 7 à 12 mois vieux mâle de type sauvage C57BL / 6 souris (poids corporel moyen: 35 ± 1 g). La figure 1 illustre la récolte des plaquettes murines de graisse épididymaire avec l' isolation ad-MVF mécanique et enzymatique subséquente. Le temps nécessaire à la récolte de matières grasses était de 30 minutes et pour l'isolement des ad-MVF était d…

Discussion

Dans cette étude, nous présentons un protocole bien établi pour l'isolement des ad-MVF. L'obtention ad-MVF du tissu adipeux de souris est une procédure simple avec quelques étapes critiques. Les souris présentent différents dépôts de graisse sous-cutanée et intra-abdominales. Comme précédemment décrit pour les rats, la source de matières grasses la plus appropriée pour l'isolement de l' ad-MVF sont les coussinets adipeux épididymaire en raison de leur taille, de structure homogène et une…

Materials

1.5-mL conical microcentrifuge tube	VWR, Kelsterbach, Germany	700-5239
100-µL precision pipette	Eppendorf, Hamburg, Germany	4920000059
10-mL measuring pipette	Costar, Corning Inc., New York, USA	4488
14-mL PP tubes	Greiner bio-one, Frickenhausen, Germany	187261
1-mL precision pipette	Eppendorf, Hamburg, Germany	4920000083
500-µm filter (pluriStrainer 500 µm)	HISS Diagnostics, Freiburg, Germany	43-50500-03
50-mL conical centrifuge tube	Greiner bio-one, Frickenhausen, Germany	227261
50-mL Erlenmeyer flask	VWR, Kelsterbach, Germany	214-0211
96-well plate	Greiner bio-one, Frickenhausen, Germany	65518
cell detachment solution (Accutase)	eBioscience, San Diego, CA USA	00-4555-56
C57BL/6 mice	Charles River, Cologne, Germany	027
C57BL/6-Tg(CAG-EGFP)1Osb/J mice	The Jackson Laboratory, Bar Harbor, USA	003291
CD117-FITC	BD Biosciences, Heidelberg, Germany	553373
CD31-PE	BD Biosciences, Heidelberg, Germany	553354
Collagenase NB4G	Serva Electrophoresis GmbH, Heidelberg, Germany	17465.02	Lot tested by manufacturer for enzymatic activity
Dissection scissors	Braun Aesculap AG &CoKG, Melsungen, Germany	BC 601
DNA-binding dye (Bisbenzimide H33342)	Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Germany	B2261
Dulbecco's modified Eagle medium (DMEM)	PAN Biotech, Rickenbach, Germany	P04-03600
Fetal calf serum (FCS)	Biochrom GmbH, Berlin, Germany	S0615
Fine forceps	S&T AG, Neuhausen, Switzerland	FRS-15 RM-8
Fine scissors	World Precision Instrumets, Sarasota, FL, USA	503261
Dermal skin substitute (Integra)	Integra Life Sciences, Sain Priest, France	62021
Ketamine	Serumwerk Bernburg AG, Bernburg, Germany	7005294
M-IgG2akAL488	eBioscience, San Diego, CA USA	53-4724-80
Octeniderm (disinfecting solution)	Schülke & Mayer, Norderstedt, Germany	118211
Penicillin/Streptomycin	Biochrom, Berlin, Germany	A2213
Petri dish	Greiner bio-one, Frickenhausen, Germany	664160
Phosphate-buffered saline (PBS)	Lonza Group, Basel, Switzerland	17-516F
pluriStrainer 20-µm (20 µm filter)	HISS Diagnostics, Freiburg, Germany	43-50020-03
Rat-IgG2akFITC	BD Biosciences, Heidelberg, Germany	553988
Rat-IgG2akPE	BD Biosciences, Heidelberg, Germany	553930
Small preparation scissors	S&T AG, Neuhausen, Switzerland	SDC-15 R-8S
Surgical forceps	Braun Aesculap AG &CoKG, Melsungen, Germany	BD510R
Tape (Heftpflaster Seide) 1.25 cm	Fink & Walter GmbH, Mechweiler, Germany	1671801
Xylazine	Bayer Vital GmbH, Leverkusen, Germany	1320422
α-SMA-AL488	eBioscience, San Diego, CA USA	53-9760-82	Intracellular labeling additionally requires Cytofix/Cytoperm (BD Biosciences, Heidelberg, Germany; #554722)