조직 공학 혈관 신생 단위로 쥐 지방 조직 유래 미세 혈관 조각의 분리
Summary
우리는 유망한 혈관 단위를 대표하는 지방 조직 유래 미세 혈관 조각을 분리하는 프로토콜을 제시한다. 이들은 신속 분리 될 수 있으며, 따라서, 조직 공학 분야의 다른 한 단계 prevascularization 위해 사용될 수 있고, 체외 처리에 필요로하지 않는다.
Abstract
기능성 미세 혈관 네트워크는 생존과 설계 조직 구조의 통합을위한 중요한 중요하다. 이러한 목적을 위해, 여러 혈관 및 prevascularization 전략이 수립되었다. 그러나, 대부분의 셀 기반 접근 방식은 미세 혈관 네트워크의 형성에 시간이 많이 소요되는 체외 단계를 포함한다. 따라서, 그들은 수술 한 단계 절차에 적합하지 않다. 지방 조직 유래 미세 혈관 조각 (광고 MVF)는 유망 혈관 단위를 나타냅니다. 그들은 쉽게 지방 조직에서 분리 및 기능성 미세 혈관의 형태를 나타낼 수 있습니다. 또한, 이들은 생체 빠르게 주입 후 새로운 미세 혈관 망으로 조립. 또한, 광고 MVF은 림프관을 유도하는 것으로 나타났다. 마지막으로, 그들은 더 높은 혈관 잠재력에 기여할 수 중간 엽 줄기 세포의 풍부한 소스. 이전의 연구에서 우리는 놀라운 vascularizati을 증명하고있다설계 뼈와 피부 대체에 광고 MVF의 용량에. 본 연구에서 우리는 쥐의 지방 조직에서 광고 MVF의 효소 분리를위한 표준화 된 프로토콜에보고한다.
Introduction
조직 공학에서는 생체 대응 1, 2에서 불가능한 기능을 복원하거나 보강 조직 및 장기를 유지한다 대체품의 제조에 초점을 맞추고있다. 조직 공학 구조물의 운명은 결정적 적절한 혈관 3에 의존한다. 이러한 구조 내에서 미세 혈관 네트워크는 계층 적으로받는 사람의 혈관 4 inosculation 후 효율적인 혈액 관류를 허용하는 소동맥, 모세 혈관과 정맥으로 구성되어야한다. 이러한 네트워크의 생성은 조직 공학의 주요 과제 중 하나입니다. 이를 위해 실험 혈관 전략의 폭 넓은 스펙트럼은 지난 20 년 5, 6을 통해 소개되었다.
혈관 접근 방식은 설계, 담배 마는으로받는 미세 혈관의 증식을 자극이러한 성장의 혼입 7 요인 구조적 또는 물리 골격 변형 수단에 의해 단말. 그러나 대형 입체 구조의 혈관에 대한 혈관 신생에 의존하는 전략은 크게 미세 혈관 (8) 개발의 느린 성장 속도에 의해 제한됩니다.
조직들은 주입하기 전에 9 내에 구축 반대로 prevascularization의 개념은 네트워크 기능 미세 혈관의 생성을 목적으로한다. 종래 prevascularization는 골격 내의 내피 세포 벽화 세포 또는 줄기 세포 (10)와 같은 혈관 형성 세포의 공동 배양을 포함한다. 미세 혈관 망 형성 후 prevascularized 구조이어서 조직 결함을 주입 할 수있다. 이 복잡하고 시간이 많이 소요되는 체외 기반으로하기 때문에 주목,이 prevascularization 접근 방식은 임상에 적용하기 어려운 </ EM> 주요 규제 장애물 (9)에 의해 제한되는 절차. 따라서, 폭 넓은 임상 응용 프로그램에 더 적합한 새로운 prevascularization 전략의 개발에 대한 필요성이 여전히 존재한다.
이러한 prevascularization 전략은 지방 조직 유래의 미세 혈관 단편 (AD-MVF)을 적용 할 수있다. 광고 MVF 쥐 (11), (12)와 마우스 (13)의 지방 조직에서 다량으로 수확 할 수있는 강력한 혈관 단위를 나타냅니다. 그들은 세동맥, 모세 혈관 및 루멘 생리 미세 혈관 형태를 나타내는 세정맥 용기 세그먼트 및 안정화 혈관 주위 세포를 14, 15로 구성된다. 이 독특한 기능은 precultivation없이 조직 결함에 광고 MVF 시드 발판의 즉각적인 이식을 할 수 있습니다. 이 광고-MVF 빠르게에서 재 조립기능성 미세 혈관 네트워크. 또한, 광고 MVF은 또한 자신의 놀라운 재생 능력에 기여할 수 중간 엽 줄기 세포 (16)의 풍부한 소스를 나타냅니다. 따라서, 광고 MVF 점점 조직 공학 14, 15, 17, 18, 19, 20, 21의 다양한 분야에서 사용된다.
광고 MVF의 분리는 원래 12 쥐 11 년에 설립되었습니다. 여기서, 우리는 부고환 지방 패드에서 쥐의 광고 MVF의 표준화 분리를 허용하는 프로토콜을 설명합니다. 이 형질 전환 마우스 모델을 사용하여 광고 MVF 기능을 기본 분자 메커니즘에 더 많은 통찰력을 제공 할 수있다.
Protocol
Representative Results
Discussion
이 연구에서 우리는 광고 MVF의 절연을위한 잘 확립 된 프로토콜을 제시한다. 쥐의 지방 조직에서 광고 MVF을 얻는 것은 몇 가지 중요한 단계를 간단한 절차입니다. 마우스는 다른 피하 및 복강 내 지방 예금을 나타낸다. 이전에 래트에 대해 기재된 바와 같이, 광고 MVF의 분리를위한 가장 적합한 지방 원 인해 큰 혈관 (11) 크기, 균일 한 구조와 최소한의 오염 (1…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
우리는 재닌 베커, 캐롤라인 비켈만와 루스 니클스의 우수한 기술 지원을 감사하고 있습니다. (- 독일 연구 재단 DFG) – LA 2682 / 7-1 본 연구는 독일 Forschungsgemeinschaft의 연구비 지원을 받았다.
Materials
| 1.5-mL conical microcentrifuge tube | VWR, Kelsterbach, Germany | 700-5239 | |
| 100-µL precision pipette | Eppendorf, Hamburg, Germany | 4920000059 | |
| 10-mL measuring pipette | Costar, Corning Inc., New York, USA | 4488 | |
| 14-mL PP tubes | Greiner bio-one, Frickenhausen, Germany | 187261 | |
| 1-mL precision pipette | Eppendorf, Hamburg, Germany | 4920000083 | |
| 500-µm filter (pluriStrainer 500 µm) | HISS Diagnostics, Freiburg, Germany | 43-50500-03 | |
| 50-mL conical centrifuge tube | Greiner bio-one, Frickenhausen, Germany | 227261 | |
| 50-mL Erlenmeyer flask | VWR, Kelsterbach, Germany | 214-0211 | |
| 96-well plate | Greiner bio-one, Frickenhausen, Germany | 65518 | |
| cell detachment solution (Accutase) | eBioscience, San Diego, CA USA | 00-4555-56 | |
| C57BL/6 mice | Charles River, Cologne, Germany | 027 | |
| C57BL/6-Tg(CAG-EGFP)1Osb/J mice | The Jackson Laboratory, Bar Harbor, USA | 003291 | |
| CD117-FITC | BD Biosciences, Heidelberg, Germany | 553373 | |
| CD31-PE | BD Biosciences, Heidelberg, Germany | 553354 | |
| Collagenase NB4G | Serva Electrophoresis GmbH, Heidelberg, Germany | 17465.02 | Lot tested by manufacturer for enzymatic activity |
| Dissection scissors | Braun Aesculap AG &CoKG, Melsungen, Germany | BC 601 | |
| DNA-binding dye (Bisbenzimide H33342) | Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Germany | B2261 | |
| Dulbecco's modified Eagle medium (DMEM) | PAN Biotech, Rickenbach, Germany | P04-03600 | |
| Fetal calf serum (FCS) | Biochrom GmbH, Berlin, Germany | S0615 | |
| Fine forceps | S&T AG, Neuhausen, Switzerland | FRS-15 RM-8 | |
| Fine scissors | World Precision Instrumets, Sarasota, FL, USA | 503261 | |
| Dermal skin substitute (Integra) | Integra Life Sciences, Sain Priest, France | 62021 | |
| Ketamine | Serumwerk Bernburg AG, Bernburg, Germany | 7005294 | |
| M-IgG2akAL488 | eBioscience, San Diego, CA USA | 53-4724-80 | |
| Octeniderm (disinfecting solution) | Schülke & Mayer, Norderstedt, Germany | 118211 | |
| Penicillin/Streptomycin | Biochrom, Berlin, Germany | A2213 | |
| Petri dish | Greiner bio-one, Frickenhausen, Germany | 664160 | |
| Phosphate-buffered saline (PBS) | Lonza Group, Basel, Switzerland | 17-516F | |
| pluriStrainer 20-µm (20 µm filter) | HISS Diagnostics, Freiburg, Germany | 43-50020-03 | |
| Rat-IgG2akFITC | BD Biosciences, Heidelberg, Germany | 553988 | |
| Rat-IgG2akPE | BD Biosciences, Heidelberg, Germany | 553930 | |
| Small preparation scissors | S&T AG, Neuhausen, Switzerland | SDC-15 R-8S | |
| Surgical forceps | Braun Aesculap AG &CoKG, Melsungen, Germany | BD510R | |
| Tape (Heftpflaster Seide) 1.25 cm | Fink & Walter GmbH, Mechweiler, Germany | 1671801 | |
| Xylazine | Bayer Vital GmbH, Leverkusen, Germany | 1320422 | |
| α-SMA-AL488 | eBioscience, San Diego, CA USA | 53-9760-82 | Intracellular labeling additionally requires Cytofix/Cytoperm (BD Biosciences, Heidelberg, Germany; #554722) |
References
- Langer, R., Vacanti, J. P. Tissue engineering. Science. 260 (5110), 920-926 (1993).
- Khademhosseini, A., Langer, R. A decade of progress in tissue engineering. Nat Protoc. 11 (10), 1775-1781 (2016).
- Novosel, E. C., Kleinhans, C., Kluger, P. J. Vascularization is the key challenge in tissue engineering. Adv Drug Deliv Rev. 63 (4-5), 300-311 (2011).
- Rouwkema, J., Khademhosseini, A. Vascularization and Angiogenesis in Tissue Engineering: Beyond Creating Static Networks. Trends Biotechnol. 34 (9), 733-745 (2016).
- Laschke, M. W., Menger, M. D. Vascularization in tissue engineering: angiogenesis versus inosculation. Eur Surg Res. 48 (2), 85-92 (2012).
- Sarker, M., Chen, X. B., Schreyer, D. J. Experimental approaches to vascularisation within tissue engineering constructs. J Biomater Sci Polym Ed. 26 (12), 683-734 (2015).
- Frueh, F. S., Menger, M. D., Lindenblatt, N., Giovanoli, P., Laschke, M. W. Current and emerging vascularization strategies in skin tissue engineering. Crit Rev Biotechnol. 20, 1-13 (2016).
- Utzinger, U., Baggett, B., Weiss, J. A., Hoying, J. B., Edgar, L. T. Large-scale time series microscopy of neovessel growth during angiogenesis. Angiogenesis. 18 (3), 219-232 (2015).
- Laschke, M. W., Menger, M. D. Prevascularization in tissue engineering: Current concepts and future directions. Biotechnol Adv. 34 (2), 112-121 (2016).
- Baiguera, S., Ribatti, D. Endothelialization approaches for viable engineered tissues. Angiogenesis. 16 (1), 1-14 (2013).
- Wagner, R. C., Kreiner, P., Barrnett, R. J., Bitensky, M. W. Biochemical characterization and cytochemical localization of a catecholamine-sensitive adenylate cyclase in isolated capillary endothelium. Proc Natl Acad Sci U S A. 69 (11), 3175-3179 (1972).
- Wagner, R. C., Matthews, M. A. The isolation and culture of capillary endothelium from epididymal fat. Microvasc Res. 10 (3), 286-297 (1975).
- Laschke, M. W., Menger, M. D. Adipose tissue-derived microvascular fragments: natural vascularization units for regenerative medicine. Trends Biotechnol. 33 (8), 442-448 (2015).
- Laschke, M. W., et al. Vascularisation of porous scaffolds is improved by incorporation of adipose tissue-derived microvascular fragments. Eur Cell Mater. 24, 266-277 (2012).
- Frueh, F. S., et al. Adipose tissue-derived microvascular fragments improve vascularization, lymphangiogenesis and integration of dermal skin substitutes. J Invest Dermatol. 137 (1), 217-227 (2017).
- McDaniel, J. S., Pilia, M., Ward, C. L., Pollot, B. E., Rathbone, C. R. Characterization and multilineage potential of cells derived from isolated microvascular fragments. J Surg Res. 192 (1), 214-222 (2014).
- Nakano, M., et al. Effect of autotransplantation of microvessel fragments on experimental random-pattern flaps in the rat. Eur Surg Res. 30 (3), 149-160 (1998).
- Nakano, M., et al. Successful autotransplantation of microvessel fragments into the rat heart. Eur Surg Res. 31 (3), 240-248 (1999).
- Shepherd, B. R., Hoying, J. B., Williams, S. K. Microvascular transplantation after acute myocardial infarction. Tissue Eng. 13 (12), 2871-2879 (2007).
- Pilia, M., et al. Transplantation and perfusion of microvascular fragments in a rodent model of volumetric muscle loss injury. Eur Cell Mater. 28, 11-23 (2014).
- Laschke, M. W., et al. Adipose tissue-derived microvascular fragments from aged donors exhibit an impaired vascularisation capacity. Eur Cell Mater. 28, 287-298 (2015).
- Okabe, M., Ikawa, M., Kominami, K., Nakanishi, T., Nishimune, Y. ‘Green mice’ as a source of ubiquitous green cells. FEBS Lett. 407 (3), 313-319 (1997).
- Honek, J., et al. Modulation of age-related insulin sensitivity by VEGF-dependent vascular plasticity in adipose tissues. Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (41), 14906-14911 (2014).
- Cho, C. H., et al. Angiogenic role of LYVE-1-positive macrophages in adipose tissue. Circ Res. 100 (4), e47-e57 (2007).
- Han, S., Sun, H. M., Hwang, K. C., Kim, S. W. Adipose-Derived Stromal Vascular Fraction Cells: Update on Clinical Utility and Efficacy. Crit Rev Eukaryot Gene Expr. 25 (2), 145-152 (2015).
- Chen, Y. J., et al. Isolation and Differentiation of Adipose-Derived Stem Cells from Porcine Subcutaneous Adipose Tissues. J Vis Exp. (109), e53886 (2016).
- Guillaume-Jugnot, P., et al. Autologous adipose-derived stromal vascular fraction in patients with systemic sclerosis: 12-month follow-up. Rheumatology (Oxford). 55 (2), 301-306 (2016).
- Tissiani, L. A., Alonso, N. A Prospective and Controlled Clinical Trial on Stromal Vascular Fraction Enriched Fat Grafts in Secondary Breast Reconstruction. Stem Cells Int. , 2636454 (2016).
- Calcagni, M., et al. The novel treatment of SVF-enriched fat grafting for painful end-neuromas of superficial radial nerve. Microsurgery. , (2016).
- Hoying, J. B., Boswell, C. A., Williams, S. K. Angiogenic potential of microvessel fragments established in three-dimensional collagen gels. In Vitro Cell Dev Biol Anim. 32 (7), 409-419 (1996).
- Kirkpatrick, N. D., Andreou, S., Hoying, J. B., Utzinger, U. Live imaging of collagen remodeling during angiogenesis. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 292 (6), H3198-H3206 (2007).
