Apresenta-se um protocolo para isolar fragmentos microvasculares derivadas de tecido adiposo que representam unidades de vascularização promissores. Eles podem ser isolados rapidamente, não requerem processamento in vitro e, assim, pode ser utilizado para prevascularization um passo em diferentes campos da engenharia de tecidos.
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Artigo de método
Isolamento de Murino adiposo derivada de tecido microvascular Fragmentos como Vascularização Unidades para engenharia de tecidos
Neste artigo
Resumo
Resumo
Uma rede microvascular funcional é de importância crucial para a sobrevivência e integração de construções de tecido de engenharia. Para isso, várias estratégias angiogênicos e prevascularization foram estabelecidas. No entanto, a maioria das abordagens com base em células in vitro incluem passos que consomem tempo para a formação de uma rede microvascular. Assim, eles não são adequados para procedimentos de uma etapa intra-operatórios. Adiposos fragmentos microvasculares derivadas de tecido (ad-MVF) representam unidades de vascularização promissores. Eles podem ser facilmente isolados a partir de tecido gordo e exibem uma morfologia de microvasos funcional. Além disso, eles rapidamente remontar em novas redes microvasculares após implantação in vivo. Além disso, ad-MVF foram mostrados para induzir linfangiogênese. Finalmente, eles são uma fonte rica de células-tronco mesenquimais, que pode ainda contribuir para o seu alto potencial de vascularização. Em estudos anteriores que demonstraram a vascularizati notávelna capacidade de ad-MVF em substitutos ósseos e pele de engenharia. No presente estudo, são descritos em um protocolo padronizado para o isolamento enzimático de ad-MVF de tecido adiposo murino.
Introdução
A engenharia de tecidos centra-se na fabricação de tecidos e de órgãos substitutos que manter, aumentar ou restaurar a função de inoperável em homólogos in vivo 1, 2. O destino de construções de engenharia de tecidos depende essencialmente uma vascularização adequada 3. Redes microvasculares dentro dessas construções devem ser hierarquicamente organizado com arteríolas, capilares e vênulas para permitir perfusão sanguínea eficiente após inosculation a vasculatura do destinatário 4. A geração de tais redes é um dos principais desafios em engenha....
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Protocolo
Todos os procedimentos foram realizados de acordo com o Instituto Nacional de diretrizes de saúde para o uso de animais de laboratório e seguindo as orientações institucionais (Landesamt für Soziales, Gesundheit und Verbraucherschutz, Abt. Lebensmittel- und Veterinärwesen, Zentralstelle, Saarbrücken, Alemanha).
1. Preparação de Instrumentos Cirúrgicos
- Manter prontas as tesouras de dissecação, pinças cirúrgicas, uma tesoura pequena de preparação, uma pinça fina e uma placa de Petri estéril com meio de Eagle modificado por 15 ml de Dulbecco (DMEM, 10% de soro fetal de vitelo (FCS), 100 U / mL de penicilina, 0,1 mg / mL de estrept....
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Resultados
No presente estudo foi realizada seis procedimentos de isolamento ad-MVF com tecido adiposo a partir de 7- ao macho de tipo selvagem de 12 meses de idade C57BL 6 ratinhos / (peso corporal médio: 35 ± 1 g). A Figura 1 ilustra a colheita das almofadas de gordura epididimal de murino com subsequente isolamento mecânico e enzimática ad-MVF. O tempo necessário para a colheita de gordura foi de 30 minutos e para o isolamento de ad MV F foi de 120 min. No total, o processo levo.......
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Discussão
Neste estudo apresentamos um protocolo bem estabelecido para o isolamento de ad-MVF. Obtenção ad-MVF do tecido adiposo murino é um procedimento simples com alguns passos críticos. Os ratinhos exibem diferentes subcutânea e depósitos de gordura intra-abdominais. Como anteriormente descrito para os ratos, a fonte de gordura mais adequado para o isolamento de ad-MV F são as almofadas de gordura epididimal devido ao seu tamanho, estrutura homogénea e contaminação mínima com os vasos sanguíneos maiores
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Divulgações
Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.
Agradecimentos
Somos gratos pela excelente assistência técnica de Janine Becker, Caroline Bickelmann e Ruth Nickels. Este estudo foi financiado por uma concessão do Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG - Fundação Alemã de Pesquisa) - LA 2682 / 7-1.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| tubo de microcentrífuga cónico de 1,5 ml | VWR, Kelsterbach, Alemanha | 700-5239 | |
| 100-µ Pipeta de precisão L | Eppendorf, Hamburgo, Alemanha | 4920000059 | |
| Pipeta medidora de 10 mL | Costar, Corning Inc., Nova York, EUA | 4488 | |
| Tubos PP de 14 mL | Greiner bio-one, Frickenhausen, Alemanha | 187261 | |
| Pipeta de precisão de 1 mL | Eppendorf, Hamburgo, Alemanha | 4920000083 | |
| 500-µ m filtro (pluriStrainer 500 µ m) | HISS Diagnostics, Freiburg, Alemanha | 43-50500-03 | |
| Tubo de centrífuga cônico de 50 mL | Greiner bio-one, Frickenhausen, Alemanha | 227261 | |
| frasco Erlenmeyer de 50 mL | VWR, Kelsterbach, Alemanha | 214-0211 | |
| Placa de 96 poços | Greiner bio-one, Frickenhausen, Alemanha | 65518 | |
| solução de descolamento de células (Accutase) | eBioscience, San Diego, CA EUA | 00-4555-56 | |
| Camundongos C57BL/6 | Charles River, Colônia, Alemanha | 027 | |
| Camundongos C57BL/6-Tg(CAG-EGFP)1Osb/J | The Jackson Laboratory, Bar Harbor, EUA | 003291 | |
| CD117-FITC | BD Biosciences, Heidelberg, Alemanha | 553373 | |
| CD31-PE | BD Biosciences, Heidelberg, Alemanha | 553354 | |
| Colagenase NB4G | Serva Electrophoresis GmbH, Heidelberg, Alemanha | 17465.02 | Lote testado pelo fabricante quanto à atividade enzimática |
| Tesoura de dissecção | Braun Aesculap AG & CoKG, Melsungen, Alemanha | BC 601 | |
| Corante de ligação ao DNA (Bisbenzimida H33342) | Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Alemanha | B2261 | |
| Meio de Eagle modificado de Dulbecco (DMEM) | PAN Biotech, Rickenbach, Alemanha | P04-03600 | |
| Soro fetal de bezerro (FCS) | Biochrom GmbH, Berlim, Alemanha | S0615 | |
| Pinça fina | S& T AG, Neuhausen, Suíça | FRS-15 RM-8 | |
| Tesoura fina | World Precision Instrumets, Sarasota, FL, EUA | 503261 | |
| Substituto dérmico da pele (Integra) | Integra Life Sciences, Sain Priest, França | 62021 | |
| Cetamina | Serumwerk Bernburg AG, Bernburg, Alemanha | 7005294 | |
| M-IgG2akAL488 | eBioscience, San Diego, CA EUA | 53-4724-80 | |
| Octeniderm (solução desinfetante) | Schü lke & Mayer, Norderstedt, Alemanha | 118211 | |
| Penicilina/Estreptomicina | Biochrom, Berlim, Alemanha | A2213 | |
| Placa de Petri | Greiner bio-one, Frickenhausen, Alemanha | 664160 | |
| Solução salina tamponada com fosfato (PBS) | Lonza Group, Basel, Suíça | 17-516F | |
| pluriStrainer 20-µ m (20 µ filtro m) | HISS Diagnostics, Freiburg, Alemanha | 43-50020-03 | |
| Rat-IgG2akFITC | BD Biosciences, Heidelberg, Alemanha | 553988 | |
| Rat-IgG2akPE | BD Biosciences, Heidelberg, Alemanha | 553930 | |
| Tesoura de preparação pequena | S& T AG, Neuhausen, Suíça | SDC-15 R-8S | |
| Pinça cirúrgica | Braun Aesculap AG & CoKG, Melsungen, Alemanha | Fita BD510R | |
| (Heftpflaster Seide) 1,25 cm | Fink & Walter GmbH, Mechweiler, Alemanha | 1671801 | |
| Xylazine | Bayer Vital GmbH, Leverkusen, Alemanha | 1320422 | |
| α-SMA-AL488 | eBioscience, San Diego, CA EUA | 53-9760-82 | A marcação intracelular requer adicionalmente Cytofix/Cytoperm (BD Biosciences, Heidelberg, Alemanha; #554722) |
Referências
- Langer, R., Vacanti, J. P. Tissue engineering. Science. 260 (5110), 920-926 (1993).
- Khademhosseini, A., Langer, R. A decade of progress in tissue engineering. Nat Protoc. 11 (10), 1775-1781 (2016).
- Novosel, E. C., Kleinhans, C., Kluger, P. J.
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Reimpressões e permissões
