Apresenta-se um protocolo para isolar fragmentos microvasculares derivadas de tecido adiposo que representam unidades de vascularização promissores. Eles podem ser isolados rapidamente, não requerem processamento in vitro e, assim, pode ser utilizado para prevascularization um passo em diferentes campos da engenharia de tecidos.
Uma rede microvascular funcional é de importância crucial para a sobrevivência e integração de construções de tecido de engenharia. Para isso, várias estratégias angiogênicos e prevascularization foram estabelecidas. No entanto, a maioria das abordagens com base em células in vitro incluem passos que consomem tempo para a formação de uma rede microvascular. Assim, eles não são adequados para procedimentos de uma etapa intra-operatórios. Adiposos fragmentos microvasculares derivadas de tecido (ad-MVF) representam unidades de vascularização promissores. Eles podem ser facilmente isolados a partir de tecido gordo e exibem uma morfologia de microvasos funcional. Além disso, eles rapidamente remontar em novas redes microvasculares após implantação in vivo. Além disso, ad-MVF foram mostrados para induzir linfangiogênese. Finalmente, eles são uma fonte rica de células-tronco mesenquimais, que pode ainda contribuir para o seu alto potencial de vascularização. Em estudos anteriores que demonstraram a vascularizati notávelna capacidade de ad-MVF em substitutos ósseos e pele de engenharia. No presente estudo, são descritos em um protocolo padronizado para o isolamento enzimático de ad-MVF de tecido adiposo murino.
A engenharia de tecidos centra-se na fabricação de tecidos e de órgãos substitutos que manter, aumentar ou restaurar a função de inoperável em homólogos in vivo 1, 2. O destino de construções de engenharia de tecidos depende essencialmente uma vascularização adequada 3. Redes microvasculares dentro dessas construções devem ser hierarquicamente organizado com arteríolas, capilares e vênulas para permitir perfusão sanguínea eficiente após inosculation a vasculatura do destinatário 4. A geração de tais redes é um dos principais desafios em engenharia de tecidos. Para isso, um amplo espectro de estratégias de vascularização experimentais foi introduzido ao longo das últimas duas décadas 5, 6.
abordagens angiogénicos estimular o crescimento de microvasos em receptores tiss engenhariaues por meio de modificação estrutural andaime ou físico-químicas, tais como a incorporação de factores de crescimento 7. No entanto, a vascularização de grandes construes tridimensionais, estratégias dependentes da angiogénese são marcadamente limitados por baixas taxas de crescimento de microvasos a desenvolver 8.
Em contraste, o conceito de prevascularization tem como objectivo para a geração das redes microvasculares funcionais dentro do tecido constrói antes da sua implantação 9. Prevascularization convencional envolve a co-cultura de células formadoras de vasos, tais como células endoteliais, células mural ou células-tronco 10, dentro de andaimes. Após a formação da rede microvascular, as construções prevascularized pode então ser implantado num defeitos de tecidos. Contudo, tal abordagem prevascularization é difícil de aplicar em um ambiente clínico, porque se baseia no complexo e demorado in vitro </ em> procedimentos, que são restritos por grandes obstáculos regulatórios 9. Por conseguinte, existe ainda uma necessidade para o desenvolvimento de novas estratégias prevascularization que são mais adequados para uma aplicação clínica ampla.
Tal estratégia prevascularization pode ser a aplicação de fragmentos microvasculares derivadas de tecido adiposo (ad-MVF). ad-MVF representam unidades de vascularização potentes que podem ser colhidas em grandes quantidades a partir do tecido adiposo de ratos 11, 12 e 13 ratinhos. Eles consistem de arteríolas, capilares, e segmentos de vasos venulares, que exibem uma morfologia de microvasos fisiológico com um lúmen e estabilizantes células perivasculares 14, 15. Esta característica única permite a implantação imediata de andaimes ad-MVF-semeado em defeitos de tecido sem pré-cultura. Lá, o ad-MVF remontar rapidamente ema redes microvasculares funcionais. Além disso, ad-MVF representam uma rica fonte de células-tronco mesenquimais 16, que pode ainda contribuir para a sua capacidade de regeneração impressionante. Por conseguinte, ad-MV F são cada vez mais utilizado em diferentes campos da engenharia de tecidos 14, 15, 17, 18, 19, 20, 21.
O isolamento de ad-MVF foi estabelecida originalmente em ratos 11, 12. Aqui, nós descrevemos um protocolo, que permite o isolamento padronizado de murino ad-MVF de almofadas de gordura epididimal. Isto pode facilitar uma melhor compreensão sobre os mecanismos moleculares subjacentes à função de ad-MVF usando modelos de ratinhos transgénicos.
Neste estudo apresentamos um protocolo bem estabelecido para o isolamento de ad-MVF. Obtenção ad-MVF do tecido adiposo murino é um procedimento simples com alguns passos críticos. Os ratinhos exibem diferentes subcutânea e depósitos de gordura intra-abdominais. Como anteriormente descrito para os ratos, a fonte de gordura mais adequado para o isolamento de ad-MV F são as almofadas de gordura epididimal devido ao seu tamanho, estrutura homogénea e contaminação mínima com os vasos sanguíneos maiores <sup class…
The authors have nothing to disclose.
Somos gratos pela excelente assistência técnica de Janine Becker, Caroline Bickelmann e Ruth Nickels. Este estudo foi financiado por uma concessão do Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG – Fundação Alemã de Pesquisa) – LA 2682 / 7-1.
1.5-mL conical microcentrifuge tube | VWR, Kelsterbach, Germany | 700-5239 | |
100-µL precision pipette | Eppendorf, Hamburg, Germany | 4920000059 | |
10-mL measuring pipette | Costar, Corning Inc., New York, USA | 4488 | |
14-mL PP tubes | Greiner bio-one, Frickenhausen, Germany | 187261 | |
1-mL precision pipette | Eppendorf, Hamburg, Germany | 4920000083 | |
500-µm filter (pluriStrainer 500 µm) | HISS Diagnostics, Freiburg, Germany | 43-50500-03 | |
50-mL conical centrifuge tube | Greiner bio-one, Frickenhausen, Germany | 227261 | |
50-mL Erlenmeyer flask | VWR, Kelsterbach, Germany | 214-0211 | |
96-well plate | Greiner bio-one, Frickenhausen, Germany | 65518 | |
cell detachment solution (Accutase) | eBioscience, San Diego, CA USA | 00-4555-56 | |
C57BL/6 mice | Charles River, Cologne, Germany | 027 | |
C57BL/6-Tg(CAG-EGFP)1Osb/J mice | The Jackson Laboratory, Bar Harbor, USA | 003291 | |
CD117-FITC | BD Biosciences, Heidelberg, Germany | 553373 | |
CD31-PE | BD Biosciences, Heidelberg, Germany | 553354 | |
Collagenase NB4G | Serva Electrophoresis GmbH, Heidelberg, Germany | 17465.02 | Lot tested by manufacturer for enzymatic activity |
Dissection scissors | Braun Aesculap AG &CoKG, Melsungen, Germany | BC 601 | |
DNA-binding dye (Bisbenzimide H33342) | Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Germany | B2261 | |
Dulbecco's modified Eagle medium (DMEM) | PAN Biotech, Rickenbach, Germany | P04-03600 | |
Fetal calf serum (FCS) | Biochrom GmbH, Berlin, Germany | S0615 | |
Fine forceps | S&T AG, Neuhausen, Switzerland | FRS-15 RM-8 | |
Fine scissors | World Precision Instrumets, Sarasota, FL, USA | 503261 | |
Dermal skin substitute (Integra) | Integra Life Sciences, Sain Priest, France | 62021 | |
Ketamine | Serumwerk Bernburg AG, Bernburg, Germany | 7005294 | |
M-IgG2akAL488 | eBioscience, San Diego, CA USA | 53-4724-80 | |
Octeniderm (disinfecting solution) | Schülke & Mayer, Norderstedt, Germany | 118211 | |
Penicillin/Streptomycin | Biochrom, Berlin, Germany | A2213 | |
Petri dish | Greiner bio-one, Frickenhausen, Germany | 664160 | |
Phosphate-buffered saline (PBS) | Lonza Group, Basel, Switzerland | 17-516F | |
pluriStrainer 20-µm (20 µm filter) | HISS Diagnostics, Freiburg, Germany | 43-50020-03 | |
Rat-IgG2akFITC | BD Biosciences, Heidelberg, Germany | 553988 | |
Rat-IgG2akPE | BD Biosciences, Heidelberg, Germany | 553930 | |
Small preparation scissors | S&T AG, Neuhausen, Switzerland | SDC-15 R-8S | |
Surgical forceps | Braun Aesculap AG &CoKG, Melsungen, Germany | BD510R | |
Tape (Heftpflaster Seide) 1.25 cm | Fink & Walter GmbH, Mechweiler, Germany | 1671801 | |
Xylazine | Bayer Vital GmbH, Leverkusen, Germany | 1320422 | |
α-SMA-AL488 | eBioscience, San Diego, CA USA | 53-9760-82 | Intracellular labeling additionally requires Cytofix/Cytoperm (BD Biosciences, Heidelberg, Germany; #554722) |