Wir stellen ein Protokoll Fettgewebe stamm mikrovaskulärer Fragmente zu isolieren, die viel versprechende Vaskularisierung Einheiten darstellen. Sie können schnell isoliert werden, erfordern nicht in vitro – Prozessierung und somit für Prävaskularisation Ein-Schritt verwendet werden kann , in verschiedenen Bereichen des Tissue Engineering.
Ein funktionelles mikrovaskulären Netzwerk ist von entscheidenden Bedeutung für das Überleben und die Integration von Engineered Gewebekonstrukten. Zu diesem Zweck wurden mehrere angiogene und Prävaskularisation Strategien etabliert. Allerdings sind die meisten zellbasierte Ansätze sind zeitraubend in vitro Schritte zur Bildung eines mikrovaskulären Netzwerk. Daher sind sie für die intraoperative Ein-Schritt-Verfahren nicht geeignet. Fettgewebe abgeleiteten mikrovaskulärer Fragmente (ad-MVF) stellen vielversprechende Vaskularisierung Einheiten. Sie lassen sich leicht aus Fettgewebe und weisen eine funktionelle microvessel Morphologie isoliert werden. Darüber hinaus wieder zusammenbauen sie schnell in neue mikrovaskuläre Netzwerke nach Implantation in vivo. Darüber hinaus Ad-MVF wurde Lymphangiogenese induziert. Schließlich sind sie eine reiche Quelle von mesenchymalen Stammzellen, die weiterhin ihre hohen Potential Vaskularisierung beitragen können. In früheren Studien haben wir die bemerkenswerte vascularizati demonstriertauf der Kapazität des Ad-MVF in engineered Knochen und Hautersatz. In der vorliegenden Studie berichten wir über ein standardisiertes Protokoll für die enzymatische Trennung von Ad-MVF aus murinen Fettgewebe.
Tissue Engineering konzentriert sich auf der Herstellung von Gewebe- und Organersatz , die erhalten, wiederzuherzustellen oder die Funktion des inoperablen in vivo Pendants 1, 2 zu erhöhen. Das Schicksal von Engineered Gewebekonstrukten hängt entscheidend von einer adäquaten Vaskularisation 3. Die mikrovaskuläre Netzwerke innerhalb dieser Konstrukte hierarchisch mit Arteriolen, Kapillaren organisiert werden sollte, und Venolen nach inosculation der dem Empfänger Gefäß 4 effiziente Durchblutung zu ermöglichen. Die Erzeugung solcher Netzwerke gehört zu den wichtigsten Herausforderungen in Tissue Engineering. Zu diesem Zweck wird ein breites Spektrum von experimenteller Vaskularisierung Strategien wurde in den letzten zwei Jahrzehnten eingeführt 5, 6.
Angiogenen Ansätze fördern das Einwachsen des Empfängers microvessels in engineered tissUEs durch strukturelle oder physikochemischen Gerüstmodifikation, wie beispielsweise die Einarbeitung von Wachstumsfaktoren 7. Doch für die Vaskularisierung von großen dreidimensionalen Konstrukten, Angiogenese-abhängigen Strategien werden durch langsame Wachstumsraten deutlich begrenzt von microvessels 8 zu entwickeln.
Im Gegensatz dazu soll der Begriff Prävaskularisation zur Erzeugung von funktionellen mikrovaskuläre Netzwerke innerhalb des Gewebes , um ihre Implantation 9 vor konstruiert. Herkömmliche Prävaskularisation beinhaltet die Co-Kultur des gefäßbildenden Zellen, wie Endothelzellen, mural Zellen oder Stammzellen 10, innerhalb von Gerüsten. Nach mikrovaskuläre Netzwerkbildung können die prävaskularisierten Konstrukte dann in Gewebedefekte implantiert werden. Bemerkenswert, dieser Prävaskularisation Ansatz ist schwierig , in einer klinischen Einstellung zu übernehmen, weil sie auf komplexe und zeitraubend in vitro basiert </ em> Verfahren, die von den großen regulatorischen Hürden 9 begrenzt sind. Dementsprechend besteht weiterhin ein Bedarf an der Entwicklung neuartiger Prävaskularisation Strategien, die besser geeignet für eine breite klinische Anwendung sind.
Eine solche Strategie kann Prävaskularisation die Anwendung von Fettgewebe stamm mikrovaskulärer Fragmente (ad-MVF) sein. ad-MVF stellt potente Vaskularisierung 11 Einheiten , die in großen Mengen aus dem Fettgewebe von Ratten geerntet werden können, 12 und 13 Mäuse. Sie bestehen aus Arteriolen, Kapillaren und Venolen Gefäßsegmente, die eine physiologische microvessel Morphologie mit einem Lumen aufweisen , und Stabilisieren perivaskuläre Zellen 14, 15. Diese einzigartige Funktion ermöglicht die sofortige Implantation von Ad-MVF ausgesät Gerüsten in Gewebedefekten ohne Vorkultur. Dort wieder zusammenbauen der Ad-MVF schnell infunktionellen mikrovaskuläre Netzwerke. Weiterhin ad-MVF stellt eine reiche Quelle von mesenchymalen Stammzellen , 16, die mit ihrer markanten Regenerationsfähigkeit zusätzlich beitragen können. Dementsprechend ad-MVF wird zunehmend in verschiedenen Bereichen des tissue engineering 14, 15, 17, 18, 19, 20, 21 verwendet.
Die Isolierung von ad-MVF wurde ursprünglich in Ratten 11 hergestellt worden ist , 12. Hier beschreiben wir ein Protokoll, das die standardisierte Isolierung von Maus-Ad-MVF von epididymal Fettpolstern ermöglicht. Diese können vorsehen, weitere Einblicke in die molekularen Mechanismen ad-MVF Funktion zugrundeliegenden von transgenen Mausmodellen.
In dieser Studie stellen wir ein etabliertes Protokoll für die Isolierung von Ad-MVF. Ad-MVF Gewinnung von Maus-Fettgewebe ist ein einfaches Verfahren mit einigen kritischen Schritten. Mäuse zeigen verschiedene subkutane und intraabdominalem Fettdepots. Wie zuvor für Ratten beschrieben, 11 die am besten geeignete Fettquelle für die Isolierung von Ad-MVF sind die epididymal Fettpolster aufgrund ihrer Größe, homogener Struktur und minimaler Kontamination mit größeren Blutgefäßen,</su…
The authors have nothing to disclose.
Wir sind dankbar für die hervorragende technische Unterstützung von Janine Becker, Caroline Bickelmann und Ruth Nickels. (- Deutsche Forschungsgemeinschaft DFG) – LA 2682 / 7-1 Diese Studie wurde unterstützt durch einen Zuschuss von der Deutschen Forschungsgemeinschaft gefördert.
1.5-mL conical microcentrifuge tube | VWR, Kelsterbach, Germany | 700-5239 | |
100-µL precision pipette | Eppendorf, Hamburg, Germany | 4920000059 | |
10-mL measuring pipette | Costar, Corning Inc., New York, USA | 4488 | |
14-mL PP tubes | Greiner bio-one, Frickenhausen, Germany | 187261 | |
1-mL precision pipette | Eppendorf, Hamburg, Germany | 4920000083 | |
500-µm filter (pluriStrainer 500 µm) | HISS Diagnostics, Freiburg, Germany | 43-50500-03 | |
50-mL conical centrifuge tube | Greiner bio-one, Frickenhausen, Germany | 227261 | |
50-mL Erlenmeyer flask | VWR, Kelsterbach, Germany | 214-0211 | |
96-well plate | Greiner bio-one, Frickenhausen, Germany | 65518 | |
cell detachment solution (Accutase) | eBioscience, San Diego, CA USA | 00-4555-56 | |
C57BL/6 mice | Charles River, Cologne, Germany | 027 | |
C57BL/6-Tg(CAG-EGFP)1Osb/J mice | The Jackson Laboratory, Bar Harbor, USA | 003291 | |
CD117-FITC | BD Biosciences, Heidelberg, Germany | 553373 | |
CD31-PE | BD Biosciences, Heidelberg, Germany | 553354 | |
Collagenase NB4G | Serva Electrophoresis GmbH, Heidelberg, Germany | 17465.02 | Lot tested by manufacturer for enzymatic activity |
Dissection scissors | Braun Aesculap AG &CoKG, Melsungen, Germany | BC 601 | |
DNA-binding dye (Bisbenzimide H33342) | Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Germany | B2261 | |
Dulbecco's modified Eagle medium (DMEM) | PAN Biotech, Rickenbach, Germany | P04-03600 | |
Fetal calf serum (FCS) | Biochrom GmbH, Berlin, Germany | S0615 | |
Fine forceps | S&T AG, Neuhausen, Switzerland | FRS-15 RM-8 | |
Fine scissors | World Precision Instrumets, Sarasota, FL, USA | 503261 | |
Dermal skin substitute (Integra) | Integra Life Sciences, Sain Priest, France | 62021 | |
Ketamine | Serumwerk Bernburg AG, Bernburg, Germany | 7005294 | |
M-IgG2akAL488 | eBioscience, San Diego, CA USA | 53-4724-80 | |
Octeniderm (disinfecting solution) | Schülke & Mayer, Norderstedt, Germany | 118211 | |
Penicillin/Streptomycin | Biochrom, Berlin, Germany | A2213 | |
Petri dish | Greiner bio-one, Frickenhausen, Germany | 664160 | |
Phosphate-buffered saline (PBS) | Lonza Group, Basel, Switzerland | 17-516F | |
pluriStrainer 20-µm (20 µm filter) | HISS Diagnostics, Freiburg, Germany | 43-50020-03 | |
Rat-IgG2akFITC | BD Biosciences, Heidelberg, Germany | 553988 | |
Rat-IgG2akPE | BD Biosciences, Heidelberg, Germany | 553930 | |
Small preparation scissors | S&T AG, Neuhausen, Switzerland | SDC-15 R-8S | |
Surgical forceps | Braun Aesculap AG &CoKG, Melsungen, Germany | BD510R | |
Tape (Heftpflaster Seide) 1.25 cm | Fink & Walter GmbH, Mechweiler, Germany | 1671801 | |
Xylazine | Bayer Vital GmbH, Leverkusen, Germany | 1320422 | |
α-SMA-AL488 | eBioscience, San Diego, CA USA | 53-9760-82 | Intracellular labeling additionally requires Cytofix/Cytoperm (BD Biosciences, Heidelberg, Germany; #554722) |