Isolatie Murine vetweefsel afgeleide microvasculaire fragmenten als Vascularisatie eenheden voor Tissue Engineering

Summary

Wij presenteren een protocol voor vetweefsel afgeleide microvasculaire brokken belovend vascularisatie eenheden vertegenwoordigen isoleren. Ze kunnen snel worden geïsoleerd, vereisen geen in vitro verwerking en kunnen aldus worden gebruikt voor één-stap prevascularization op verschillende gebieden van weefselengineering.

Abstract

Een functionele microvasculaire netwerk van centraal belang voor de overleving en integratie van gemanipuleerde weefselconstructen. Voor dit doel zijn verscheidene angiogene en prevascularization strategieën vastgesteld. De meeste cel-gebaseerde benaderingen omvatten tijdrovende stappen in vitro voor de vorming van een microvasculaire netwerk. Ze zijn daarom niet geschikt voor intraoperatieve eenstaps werkwijzen. Vetweefsel afgeleide microvasculaire fragmenten (ad-MVF) vertegenwoordigen veelbelovende vascularisatie eenheden. Ze kunnen gemakkelijk worden geïsoleerd uit vetweefsel en vertonen een functionele microvaatje morfologie. Bovendien zijn ze snel weer in elkaar in nieuwe microvasculaire netwerken na implantatie in vivo. Daarnaast zijn er ad-MVF aangetoond dat lymfangiogenese induceren. Tenslotte ze een rijke bron van mesenchymale stamcellen, die verder kunnen bijdragen tot hun hoge vascularisatie potentieel. In eerdere studies hebben we de opmerkelijke vascularizati aangetoondop de capaciteit van de ad-MVF in engineered bot en huid substituten. In de huidige studie, doen we verslag van een gestandaardiseerd protocol voor de enzymatische isolatie van ad-MVF uit muizen vetweefsel.

Introduction

Weefselmanipulatie is gericht op de vervaardiging van weefsels en organen vervangingsmiddelen die de functie van inoperabele handhaven herstellen of versterken in vivo tegenhangers ^{1, 2.} Het lot van gemanipuleerde weefselconstructen cruciaal afhangt van een adequate vascularisatie ^3. Microvasculaire netwerken binnen deze constructies moeten hiërarchisch worden georganiseerd met kleine slagaders, haarvaten en venulen efficiënte doorbloeding na inoculatie aan het vaatstelsel van de ontvanger ⁴ mogelijk te maken. Het genereren van dergelijke netwerken is een van de belangrijkste uitdagingen in tissue engineering. Voor dit doel heeft een breed spectrum van experimentele vascularisatie strategieën geïntroduceerd in de afgelopen twee decennia ^{5, 6.}

Angiogene benaderingen stimuleren de ingroei van de ontvanger microvaten in gemanipuleerde tissUES via structurele of fysicochemische modificatie stellage, zoals de opname van groeifactoren ^7. Echter, voor de vascularisatie van grote driedimensionale constructies, angiogenese-afhankelijke strategieën sterk beperkt door de langzame groei van het ontwikkelen van microvaten ^8.

Daarentegen het begrip prevascularization richt voor het genereren van functionele microvasculaire netwerken binnen weefselconstructen vóór de implantatie ^9. Gebruikelijke prevascularization omvat de co-kweek van vat vormende cellen, bijvoorbeeld endotheelcellen, mural cellen of stamcellen ¹⁰ binnen steigers. Na de vorming microvasculaire netwerk, kan de prevascularized constructen vervolgens worden geïmplanteerd in weefseldefecten. Opmerkelijk, dit prevascularization aanpak is moeilijk toe te passen in een klinische setting, omdat het is gebaseerd op complexe en tijdrovende in vitro </ em>, welke zijn beperkt door grote obstakels in de regelgeving ^9. Derhalve is er nog steeds behoefte aan de ontwikkeling van nieuwe prevascularization strategieën die meer geschikt zijn voor een brede klinische toepassing zijn.

Prevascularization dergelijke strategie kan de toepassing van vetweefsel afgeleide microvasculaire fragmenten (ad-MVF) zijn. ad-MVF vertegenwoordigen krachtige vascularisatie eenheden die in grote hoeveelheden uit het vetweefsel van ratten ^{11, 12} en ¹³ muizen worden geoogst. Ze bestaan uit arteriolaire, capillaire en venulaire vat segmenten die een fysiologisch microvaatje morfologie vertonen met een lumen en stabiliserende perivasculaire cellen ^{14, 15.} Deze unieke functie kan de onmiddellijke implantatie van ad-MVF geplaatste steigers in het weefsel gebreken zonder precultivation. Er is de ad-MVF snel weer in elkaar inom functionele microvasculaire netwerken. Bovendien ad-MVF vormen een rijke bron van mesenchymale stamcellen ^16, die bovendien kunnen bijdragen tot hun opvallende regeneratievermogen. Dienovereenkomstig worden ad-MVF meer gebruikt in verschillende gebieden van weefselengineering ^{14, 15, 17, 18, 19, 20, 21.}

De isolatie van ad-MVF is oorspronkelijk opgericht in ratten ^{11, 12.} Hierin beschrijven we een protocol, dat de gestandaardiseerde isolatie van muizen ad-MVF maakt van epididymale vetkussentjes. Dit kan verder inzicht in de moleculaire mechanismen die ten grondslag liggen aan ad-MVF functie door het gebruik van transgene muismodellen te bieden.

Protocol

Alle procedures werden uitgevoerd volgens de National Institute of richtlijnen Health voor het gebruik van proefdieren en volgde institutionele richtlijnen (Landesamt für Soziales, Gesundheit und Verbraucherschutz, Abt. Lebensmittel- und Veterinärwesen, Zentralstelle, Saarbrücken, Duitsland). 1. Bereiding van chirurgische instrumenten Houden om de dissectie scharen, chirurgische pincet, kleine bereiding scharen, fijne pincet en een steriele Petrischaal met 15 ml Dulbecco's …

Representative Results

In dit onderzoek voerden we zes ad-MVF isolatie procedures vetweefsel van 7- tot 12-maanden oude mannelijke wild-type C57BL / 6 muizen (gemiddeld lichaamsgewicht: 35 ± 1 g). Figuur 1 toont het oogsten van murine epididymaal vetkussentjes latere mechanische en enzymatische ad-MVF isolatie. De tijd die nodig is voor het oogsten van vet was 30 minuten en voor de isolatie van ad-MVF bedroeg 120 min. In totaal heeft de procedure duurde 150 minuten. <p class="jove_content…

Discussion

In deze studie presenteren we een gevestigde protocol voor de isolatie van ad-MVF. Het verkrijgen van ad-MVF uit muizen vetweefsel is een eenvoudige procedure met een paar kritische stappen. Muizen vertonen verschillende subcutane en intra-abdominale vet. Zoals eerder beschreven voor ratten, de meest geschikte vetbron voor de isolatie van ad-MVF de epididymale vetkussentjes door hun omvang, homogene structuur en minimale verontreiniging met grotere bloedvaten ^{11, 12.<…}

Materials

1.5-mL conical microcentrifuge tube	VWR, Kelsterbach, Germany	700-5239
100-µL precision pipette	Eppendorf, Hamburg, Germany	4920000059
10-mL measuring pipette	Costar, Corning Inc., New York, USA	4488
14-mL PP tubes	Greiner bio-one, Frickenhausen, Germany	187261
1-mL precision pipette	Eppendorf, Hamburg, Germany	4920000083
500-µm filter (pluriStrainer 500 µm)	HISS Diagnostics, Freiburg, Germany	43-50500-03
50-mL conical centrifuge tube	Greiner bio-one, Frickenhausen, Germany	227261
50-mL Erlenmeyer flask	VWR, Kelsterbach, Germany	214-0211
96-well plate	Greiner bio-one, Frickenhausen, Germany	65518
cell detachment solution (Accutase)	eBioscience, San Diego, CA USA	00-4555-56
C57BL/6 mice	Charles River, Cologne, Germany	027
C57BL/6-Tg(CAG-EGFP)1Osb/J mice	The Jackson Laboratory, Bar Harbor, USA	003291
CD117-FITC	BD Biosciences, Heidelberg, Germany	553373
CD31-PE	BD Biosciences, Heidelberg, Germany	553354
Collagenase NB4G	Serva Electrophoresis GmbH, Heidelberg, Germany	17465.02	Lot tested by manufacturer for enzymatic activity
Dissection scissors	Braun Aesculap AG &CoKG, Melsungen, Germany	BC 601
DNA-binding dye (Bisbenzimide H33342)	Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Germany	B2261
Dulbecco's modified Eagle medium (DMEM)	PAN Biotech, Rickenbach, Germany	P04-03600
Fetal calf serum (FCS)	Biochrom GmbH, Berlin, Germany	S0615
Fine forceps	S&T AG, Neuhausen, Switzerland	FRS-15 RM-8
Fine scissors	World Precision Instrumets, Sarasota, FL, USA	503261
Dermal skin substitute (Integra)	Integra Life Sciences, Sain Priest, France	62021
Ketamine	Serumwerk Bernburg AG, Bernburg, Germany	7005294
M-IgG2akAL488	eBioscience, San Diego, CA USA	53-4724-80
Octeniderm (disinfecting solution)	Schülke & Mayer, Norderstedt, Germany	118211
Penicillin/Streptomycin	Biochrom, Berlin, Germany	A2213
Petri dish	Greiner bio-one, Frickenhausen, Germany	664160
Phosphate-buffered saline (PBS)	Lonza Group, Basel, Switzerland	17-516F
pluriStrainer 20-µm (20 µm filter)	HISS Diagnostics, Freiburg, Germany	43-50020-03
Rat-IgG2akFITC	BD Biosciences, Heidelberg, Germany	553988
Rat-IgG2akPE	BD Biosciences, Heidelberg, Germany	553930
Small preparation scissors	S&T AG, Neuhausen, Switzerland	SDC-15 R-8S
Surgical forceps	Braun Aesculap AG &CoKG, Melsungen, Germany	BD510R
Tape (Heftpflaster Seide) 1.25 cm	Fink & Walter GmbH, Mechweiler, Germany	1671801
Xylazine	Bayer Vital GmbH, Leverkusen, Germany	1320422
α-SMA-AL488	eBioscience, San Diego, CA USA	53-9760-82	Intracellular labeling additionally requires Cytofix/Cytoperm (BD Biosciences, Heidelberg, Germany; #554722)