Isolamento de Murino adiposo derivada de tecido microvascular Fragmentos como Vascularização Unidades para engenharia de tecidos

Summary

Apresenta-se um protocolo para isolar fragmentos microvasculares derivadas de tecido adiposo que representam unidades de vascularização promissores. Eles podem ser isolados rapidamente, não requerem processamento in vitro e, assim, pode ser utilizado para prevascularization um passo em diferentes campos da engenharia de tecidos.

Abstract

Uma rede microvascular funcional é de importância crucial para a sobrevivência e integração de construções de tecido de engenharia. Para isso, várias estratégias angiogênicos e prevascularization foram estabelecidas. No entanto, a maioria das abordagens com base em células in vitro incluem passos que consomem tempo para a formação de uma rede microvascular. Assim, eles não são adequados para procedimentos de uma etapa intra-operatórios. Adiposos fragmentos microvasculares derivadas de tecido (ad-MVF) representam unidades de vascularização promissores. Eles podem ser facilmente isolados a partir de tecido gordo e exibem uma morfologia de microvasos funcional. Além disso, eles rapidamente remontar em novas redes microvasculares após implantação in vivo. Além disso, ad-MVF foram mostrados para induzir linfangiogênese. Finalmente, eles são uma fonte rica de células-tronco mesenquimais, que pode ainda contribuir para o seu alto potencial de vascularização. Em estudos anteriores que demonstraram a vascularizati notávelna capacidade de ad-MVF em substitutos ósseos e pele de engenharia. No presente estudo, são descritos em um protocolo padronizado para o isolamento enzimático de ad-MVF de tecido adiposo murino.

Introduction

A engenharia de tecidos centra-se na fabricação de tecidos e de órgãos substitutos que manter, aumentar ou restaurar a função de inoperável em homólogos in vivo ^{1, 2.} O destino de construções de engenharia de tecidos depende essencialmente uma vascularização adequada ^3. Redes microvasculares dentro dessas construções devem ser hierarquicamente organizado com arteríolas, capilares e vênulas para permitir perfusão sanguínea eficiente após inosculation a vasculatura do destinatário ^4. A geração de tais redes é um dos principais desafios em engenharia de tecidos. Para isso, um amplo espectro de estratégias de vascularização experimentais foi introduzido ao longo das últimas duas décadas ^{5, 6.}

abordagens angiogénicos estimular o crescimento de microvasos em receptores tiss engenhariaues por meio de modificação estrutural andaime ou físico-químicas, tais como a incorporação de factores de crescimento ^7. No entanto, a vascularização de grandes construes tridimensionais, estratégias dependentes da angiogénese são marcadamente limitados por baixas taxas de crescimento de microvasos a desenvolver ^8.

Em contraste, o conceito de prevascularization tem como objectivo para a geração das redes microvasculares funcionais dentro do tecido constrói antes da sua implantação ^9. Prevascularization convencional envolve a co-cultura de células formadoras de vasos, tais como células endoteliais, células mural ou células-tronco ^10, dentro de andaimes. Após a formação da rede microvascular, as construções prevascularized pode então ser implantado num defeitos de tecidos. Contudo, tal abordagem prevascularization é difícil de aplicar em um ambiente clínico, porque se baseia no complexo e demorado in vitro </ em> procedimentos, que são restritos por grandes obstáculos regulatórios ^9. Por conseguinte, existe ainda uma necessidade para o desenvolvimento de novas estratégias prevascularization que são mais adequados para uma aplicação clínica ampla.

Tal estratégia prevascularization pode ser a aplicação de fragmentos microvasculares derivadas de tecido adiposo (ad-MVF). ad-MVF representam unidades de vascularização potentes que podem ser colhidas em grandes quantidades a partir do tecido adiposo de ratos ^{11, 12} e ¹³ ratinhos. Eles consistem de arteríolas, capilares, e segmentos de vasos venulares, que exibem uma morfologia de microvasos fisiológico com um lúmen e estabilizantes células perivasculares ^{14, 15.} Esta característica única permite a implantação imediata de andaimes ad-MVF-semeado em defeitos de tecido sem pré-cultura. Lá, o ad-MVF remontar rapidamente ema redes microvasculares funcionais. Além disso, ad-MVF representam uma rica fonte de células-tronco mesenquimais ^16, que pode ainda contribuir para a sua capacidade de regeneração impressionante. Por conseguinte, ad-MV F são cada vez mais utilizado em diferentes campos da engenharia de tecidos ^{14, 15, 17, 18, 19, 20, 21.}

O isolamento de ad-MVF foi estabelecida originalmente em ratos ^{11, 12.} Aqui, nós descrevemos um protocolo, que permite o isolamento padronizado de murino ad-MVF de almofadas de gordura epididimal. Isto pode facilitar uma melhor compreensão sobre os mecanismos moleculares subjacentes à função de ad-MVF usando modelos de ratinhos transgénicos.

Protocol

Todos os procedimentos foram realizados de acordo com o Instituto Nacional de diretrizes de saúde para o uso de animais de laboratório e seguindo as orientações institucionais (Landesamt für Soziales, Gesundheit und Verbraucherschutz, Abt. Lebensmittel- und Veterinärwesen, Zentralstelle, Saarbrücken, Alemanha). 1. Preparação de Instrumentos Cirúrgicos Manter prontas as tesouras de dissecação, pinças cirúrgicas, uma tesoura pequena de preparação, uma pinça fina e u…

Representative Results

No presente estudo foi realizada seis procedimentos de isolamento ad-MVF com tecido adiposo a partir de 7- ao macho de tipo selvagem de 12 meses de idade C57BL 6 ratinhos / (peso corporal médio: 35 ± 1 g). A Figura 1 ilustra a colheita das almofadas de gordura epididimal de murino com subsequente isolamento mecânico e enzimática ad-MVF. O tempo necessário para a colheita de gordura foi de 30 minutos e para o isolamento de ad MV F foi de 120 min. No total, o processo…

Discussion

Neste estudo apresentamos um protocolo bem estabelecido para o isolamento de ad-MVF. Obtenção ad-MVF do tecido adiposo murino é um procedimento simples com alguns passos críticos. Os ratinhos exibem diferentes subcutânea e depósitos de gordura intra-abdominais. Como anteriormente descrito para os ratos, a fonte de gordura mais adequado para o isolamento de ad-MV F são as almofadas de gordura epididimal devido ao seu tamanho, estrutura homogénea e contaminação mínima com os vasos sanguíneos maiores <sup class…

Materials

1.5-mL conical microcentrifuge tube	VWR, Kelsterbach, Germany	700-5239
100-µL precision pipette	Eppendorf, Hamburg, Germany	4920000059
10-mL measuring pipette	Costar, Corning Inc., New York, USA	4488
14-mL PP tubes	Greiner bio-one, Frickenhausen, Germany	187261
1-mL precision pipette	Eppendorf, Hamburg, Germany	4920000083
500-µm filter (pluriStrainer 500 µm)	HISS Diagnostics, Freiburg, Germany	43-50500-03
50-mL conical centrifuge tube	Greiner bio-one, Frickenhausen, Germany	227261
50-mL Erlenmeyer flask	VWR, Kelsterbach, Germany	214-0211
96-well plate	Greiner bio-one, Frickenhausen, Germany	65518
cell detachment solution (Accutase)	eBioscience, San Diego, CA USA	00-4555-56
C57BL/6 mice	Charles River, Cologne, Germany	027
C57BL/6-Tg(CAG-EGFP)1Osb/J mice	The Jackson Laboratory, Bar Harbor, USA	003291
CD117-FITC	BD Biosciences, Heidelberg, Germany	553373
CD31-PE	BD Biosciences, Heidelberg, Germany	553354
Collagenase NB4G	Serva Electrophoresis GmbH, Heidelberg, Germany	17465.02	Lot tested by manufacturer for enzymatic activity
Dissection scissors	Braun Aesculap AG &CoKG, Melsungen, Germany	BC 601
DNA-binding dye (Bisbenzimide H33342)	Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Germany	B2261
Dulbecco's modified Eagle medium (DMEM)	PAN Biotech, Rickenbach, Germany	P04-03600
Fetal calf serum (FCS)	Biochrom GmbH, Berlin, Germany	S0615
Fine forceps	S&T AG, Neuhausen, Switzerland	FRS-15 RM-8
Fine scissors	World Precision Instrumets, Sarasota, FL, USA	503261
Dermal skin substitute (Integra)	Integra Life Sciences, Sain Priest, France	62021
Ketamine	Serumwerk Bernburg AG, Bernburg, Germany	7005294
M-IgG2akAL488	eBioscience, San Diego, CA USA	53-4724-80
Octeniderm (disinfecting solution)	Schülke & Mayer, Norderstedt, Germany	118211
Penicillin/Streptomycin	Biochrom, Berlin, Germany	A2213
Petri dish	Greiner bio-one, Frickenhausen, Germany	664160
Phosphate-buffered saline (PBS)	Lonza Group, Basel, Switzerland	17-516F
pluriStrainer 20-µm (20 µm filter)	HISS Diagnostics, Freiburg, Germany	43-50020-03
Rat-IgG2akFITC	BD Biosciences, Heidelberg, Germany	553988
Rat-IgG2akPE	BD Biosciences, Heidelberg, Germany	553930
Small preparation scissors	S&T AG, Neuhausen, Switzerland	SDC-15 R-8S
Surgical forceps	Braun Aesculap AG &CoKG, Melsungen, Germany	BD510R
Tape (Heftpflaster Seide) 1.25 cm	Fink & Walter GmbH, Mechweiler, Germany	1671801
Xylazine	Bayer Vital GmbH, Leverkusen, Germany	1320422
α-SMA-AL488	eBioscience, San Diego, CA USA	53-9760-82	Intracellular labeling additionally requires Cytofix/Cytoperm (BD Biosciences, Heidelberg, Germany; #554722)