Isolering av murina adipos vävnad Microvascular Fragment som Vaskularisering Aggregat för Tissue Engineering

Summary

Vi presenterar ett protokoll för att isolera adipos vävnad mikrovaskulära fragment som representerar lovande vaskularisering enheter. De snabbt kan isoleras, inte kräver bearbetning in vitro och sålunda kan användas för ett steg prevaskularise inom olika områden av vävnadsteknik.

Abstract

En funktionell mikrovaskulära nätverket är av avgörande betydelse för överlevnad och integrering av konstruerade vävnadskonstruktioner. För detta ändamål har flera angiogena och prevaskularisering strategier fastställts. Dock de flesta cellbaserade tillvägagångssätt inkluderar tidskrävande in vitro stegen för bildningen av en mikrovaskulär nätverk. Därför är de inte lämpliga för intraoperativa ett steg förfaranden. Adipos vävnad mikrovaskulära fragment (ad-MVF) representerar lovande vaskularisering enheter. De kan lätt isoleras från fettvävnad och uppvisar en funktionell mikrokärls morfologi. Dessutom är de snabbt ihop till nya mikrovaskulära nätverk efter in vivo implantation. Dessutom har ad-MVF visats inducera lymfangiogenes. Slutligen, de är en rik källa till mesenkymala stamceller, vilket ytterligare kan bidra till deras höga vaskularisering potential. I tidigare studier har vi visat den anmärkningsvärda vascularizatipå kapaciteten hos ad-MVF i manipulerade ben och hud substitut. I den aktuella studien, vi rapporterar om ett standardiserat protokoll för enzymatisk isolering av ad-MVF från mus fettvävnad.

Introduction

Vävnadsteknik är inriktat på tillverkning av vävnads- och organersättning som upprätthålla, återställa eller förstärker funktionen av inoperabel in vivo motsvarigheter ^{1, 2.} Ödet av konstruerade vävnadskonstrukten beror ytterst på en tillräcklig vaskularisering ^3. Mikrovaskulära nätverk inom dessa konstruktioner bör hierarkiskt organiserad med arterioler, kapillärer och venoler att möjliggöra en effektiv blod perfusion efter inosculation till mottagarens kärl ^4. Alstringen av sådana nät är bland de viktigaste utmaningarna i vävnadsteknik. För detta ändamål har ett brett spektrum av experimentella vaskularisering strategier införts under de senaste två decennierna ^{5, 6.}

Angiogena metoder stimulera inväxt av mottagande mikrokärl i konstruerade tissUE: er med hjälp av strukturella eller fysikalisk-kemisk scaffold modifiering, såsom inkorporeringen av tillväxtfaktorerna ^7. Men för vaskularisering av stora tredimensionella konstruktioner, angiogenesberoende strategier markant begränsas av långsamma tillväxttakten för att utveckla mikrokärl ^8.

I kontrast, begreppet prevaskularise syftar för generering av funktionella mikrovaskulära nätverk inom vävnad konstruktioner före deras implantering ^9. Konventionell prevaskularise involverar samodling av kärlbildande celler, såsom endotelceller, väggmålning celler eller stamceller ^10, inom byggnadsställningar. Efter mikrovaskulära nätverksbildning, kan de prevascularized konstruktioner sedan implanteras i vävnadsdefekter. Anmärkningsvärt är detta prevaskularisering metod svårt att tillämpa i en klinisk miljö, eftersom det bygger på komplexa och tidskrävande in vitro </ em> förfaranden, som är begränsade av stora regleringshinder ^9. Följaktligen finns det fortfarande ett behov av utveckling av nya prevaskularisering strategier som är mer lämpade för en bred klinisk tillämpning.

Sådan prevaskularise strategi kan vara appliceringen av adipos vävnad mikrovaskulära fragment (ad-MVf) framåt. ad-MVF representerar potenta vaskularisering heter som kan skördas i stora mängder från fettvävnad hos råttor ^{11, 12} och möss ^13. De består av arteriolär, kapillär, och venular fartygssegment, vilka uppvisar en fysiologisk mikrokärls morfologi med en lumen och stabiliserande perivaskulära celler ^{14, 15.} Denna unika funktion gör det möjligt att omedelbart implantation av ad-MVF-seedade ställningar i vävnadsdefekter utan precultivation. Där ad-MVF snabbt ihop ifunktionella mikrovaskulära nätverk. Vidare ad-MVF representerar en rik källa av mesenkymala stamceller ^16, som dessutom kan bidra till deras slående regenerativ kapacitet. Följaktligen är ad-MVF används alltmer inom olika områden av vävnadsteknik ^{14, 15, 17, 18, 19, 20, 21.}

Isoleringen av ad-MVF har ursprungligen etablerats i råttor ^{11, 12.} Häri beskriver vi ett protokoll som gör det möjligt att standardiserade isoleringen av mus ad-MVF från epididymis fettkuddar. Detta kan ge ytterligare insikter i molekylära mekanismerna bakom ad-MVF-funktion genom att använda transgena musmodeller.

Protocol

Alla förfaranden utfördes i enlighet med National Institute of Health riktlinjer för användning av försöksdjur och följde institutionella riktlinjer (Landesamt für Soziales, Gesundheit und Verbraucherschutz, Abt. Lebensmittel- und Veterinärwesen, Zentralstelle, Saarbrücken, Tyskland). 1. Framställning av kirurgiska instrument Hålla redo de dissektion sax, kirurgiska pincetter, små framställnings sax, fin pincett och en steril petriskål med 15 ml Dulbeccos modifierad…

Representative Results

I föreliggande studie utförde vi sex ad-MVF isoleringsförfaranden med fettvävnad från 7- till 12-månader gammal hane av vildtyp C57BL / 6-möss (genomsnittlig kroppsvikt: 35 ± 1 g). Figur 1 illustrerar skörd av murina epididymal fettkuddar med efterföljande mekanisk och enzymatisk ad-MVF isolering. Den tid som krävs för skörd av fett var 30 min och för isolering av ad-MVF var 120 min. Totalt tog förfarandet 150 min. <p class="jove_content" fo:keep-toget…

Discussion

I denna studie presenterar vi ett väletablerat protokoll för isolering av ad-MVF. Att få ad-MVF från mus fettvävnad är en enkel procedur med några viktiga steg. Möss uppvisar olika subkutan och intraabdominella fettdepåer. Som tidigare beskrivits för råttor, den mest lämpliga fettkällan för isoleringen av ad-MVF är de epididymala fettkuddarna grund av sin storlek, homogen struktur och minimal förorening med större blodkärl ^{11, 12.} I kontrast, s…

Materials

1.5-mL conical microcentrifuge tube	VWR, Kelsterbach, Germany	700-5239
100-µL precision pipette	Eppendorf, Hamburg, Germany	4920000059
10-mL measuring pipette	Costar, Corning Inc., New York, USA	4488
14-mL PP tubes	Greiner bio-one, Frickenhausen, Germany	187261
1-mL precision pipette	Eppendorf, Hamburg, Germany	4920000083
500-µm filter (pluriStrainer 500 µm)	HISS Diagnostics, Freiburg, Germany	43-50500-03
50-mL conical centrifuge tube	Greiner bio-one, Frickenhausen, Germany	227261
50-mL Erlenmeyer flask	VWR, Kelsterbach, Germany	214-0211
96-well plate	Greiner bio-one, Frickenhausen, Germany	65518
cell detachment solution (Accutase)	eBioscience, San Diego, CA USA	00-4555-56
C57BL/6 mice	Charles River, Cologne, Germany	027
C57BL/6-Tg(CAG-EGFP)1Osb/J mice	The Jackson Laboratory, Bar Harbor, USA	003291
CD117-FITC	BD Biosciences, Heidelberg, Germany	553373
CD31-PE	BD Biosciences, Heidelberg, Germany	553354
Collagenase NB4G	Serva Electrophoresis GmbH, Heidelberg, Germany	17465.02	Lot tested by manufacturer for enzymatic activity
Dissection scissors	Braun Aesculap AG &CoKG, Melsungen, Germany	BC 601
DNA-binding dye (Bisbenzimide H33342)	Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Germany	B2261
Dulbecco's modified Eagle medium (DMEM)	PAN Biotech, Rickenbach, Germany	P04-03600
Fetal calf serum (FCS)	Biochrom GmbH, Berlin, Germany	S0615
Fine forceps	S&T AG, Neuhausen, Switzerland	FRS-15 RM-8
Fine scissors	World Precision Instrumets, Sarasota, FL, USA	503261
Dermal skin substitute (Integra)	Integra Life Sciences, Sain Priest, France	62021
Ketamine	Serumwerk Bernburg AG, Bernburg, Germany	7005294
M-IgG2akAL488	eBioscience, San Diego, CA USA	53-4724-80
Octeniderm (disinfecting solution)	Schülke & Mayer, Norderstedt, Germany	118211
Penicillin/Streptomycin	Biochrom, Berlin, Germany	A2213
Petri dish	Greiner bio-one, Frickenhausen, Germany	664160
Phosphate-buffered saline (PBS)	Lonza Group, Basel, Switzerland	17-516F
pluriStrainer 20-µm (20 µm filter)	HISS Diagnostics, Freiburg, Germany	43-50020-03
Rat-IgG2akFITC	BD Biosciences, Heidelberg, Germany	553988
Rat-IgG2akPE	BD Biosciences, Heidelberg, Germany	553930
Small preparation scissors	S&T AG, Neuhausen, Switzerland	SDC-15 R-8S
Surgical forceps	Braun Aesculap AG &CoKG, Melsungen, Germany	BD510R
Tape (Heftpflaster Seide) 1.25 cm	Fink & Walter GmbH, Mechweiler, Germany	1671801
Xylazine	Bayer Vital GmbH, Leverkusen, Germany	1320422
α-SMA-AL488	eBioscience, San Diego, CA USA	53-9760-82	Intracellular labeling additionally requires Cytofix/Cytoperm (BD Biosciences, Heidelberg, Germany; #554722)