小鼠骨骼肌形态及纤维型成分的半自动化分析
Summary
肌球蛋白重链异构体的免疫组织化学染色已成为骨骼肌纤维型 (即、i 型、类型 IIA、类型 IIX、类型 IIB) 的最先进的鉴别器。在这里, 我们提出了一个染色协议和一个新的半自动算法, 促进纤维型和纤维形态的快速评估。
Abstract
近年来, 肌球蛋白-atp 酶染色法对骨骼肌纤维类型的差异进行了最佳的可视化。近年来, 肌球蛋白重链 (MyHC) 异构体的免疫组织化学染色逐渐成为纤维型的一种较细的鉴别。I 型, 类型 IIA, 类型 IIX 和类型 IIB 纤维现在可以根据他们的 MyHC 轮廓精确识别;但是, 手动分析这些数据可能是缓慢和向下-右单调乏味的。在这方面, 快速、准确地评估纤维类成分和形态是一个非常理想的工具。在这里, 我们提出了一项协议的最先进的免疫组化染色的 MyHCs 在冰冻切片从小鼠后肢肌肉与一个新的半自动算法, 加速分析纤维型和纤维形态。正如预期的, 比目鱼肌显示染色 I 型和类型 IIA 纤维, 但不是类型 IIX 或类型 IIB 纤维。另一方面, 胫骨前肌主要由 IIX 型和 IIB 纤维组成, 一小部分的 IIA 型纤维和很少或没有 I 型纤维。为了测量纤维形态的不同方面 (即、横截面积 (CSA)、最大和最小 Feret 直径), 采用了几种图像变换来生成概率图。然后将这些参数获得的值与手动获取的值进行比较。在 CSA、最大或最小 Feret 直径 (全部为p和 #62; 0.05) 中, 两种分析方法均无显著性差异, 说明了本法的准确性。因此, 我们的免疫分析协议可以应用于对许多衰老和肌病模型中肌肉组成的影响的研究。
Introduction
众所周知, 骨骼肌是由多种类型的单纤维组成的1。最初, 两组纤维的特点是根据其收缩特性和命名, 适当, 慢抽搐 (i 型) 和快速抽搐 (II 型)。这些类别在纤维新陈代谢的基础上进一步被区别。由于 I 型纤维富含线粒体, 并依赖于氧化代谢, 它们由稳健的正烟酰胺腺嘌呤核苷酸-唑还原酶 (NADH) 酶2或琥珀酸脱氢酶 (SDH)3染色.相比之下, II 型纤维表现出较小的和可变程度的 NADH TR 酶或 SDH 染色, 分为两个快速抽搐亚组 (类型 IIA 和类型 IIB) 有些粗略的基础上, 他们的相对氧化能力。纤维的这些区别通过肌球蛋白-atp 酶染色更有效地被形象化了在 pre-incubation 在 ph 值4.0 和类型 IIB 纤维以后吸收沉淀在 ph 10.0 与类型 IIA 纤维的 I 型纤维染黑。染色中等4。
最近, 肌球蛋白重链 (MyHC) 异构体的免疫组织化学染色已经成为纤维型5的更精细的鉴别器。I 型, 类型 IIA 和类型 IIB 纤维都可以根据他们的 MyHC 轮廓精确识别。此外, 另一种快速抽搐新陈代谢-中间纤维类型, 类型 IIX, 已被确定为6。表示多个 MyHC 的混杂光纤也已被确认5,7,8。一些物种, 如猫和狒狒已知不表达类型 IIB MyHCs6。虽然 MyHC 免疫是目前最先进的评估肌肉组成, 通过这种技术获得的数据的分析是繁琐和耗时, 没有自动援助。为此, 少数的半自动方法来分析这些数据已经开发了5,9,10。在这里, 我们提出了一个相对标准的协议的肌肉纤维的免疫组织化学鉴定类型5,7,8,10,以及一个新的半自动加速分析纤维型和纤维形态的算法。
Protocol
Representative Results
Discussion
在这里, 我们为骨骼肌纤维类型的鉴定提供了有用的方向。在这样的情况下, 我们描述了一种新的数据分析算法。
由于我们的结果在很大程度上证实了以前的报告5,8,10 , 并反映了我们自己的手动测量, 所以该算法看起来是准确的。尽管如此, 我们还是遇到了一些不常见的实验陷阱, 包括切片工件造成的光纤边…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
我们感谢 Boettcher 基金会和肌萎缩侧索硬化协会 (#17 II-344) 对这项研究的支持。
Materials
| Bovine Serum Albumin | Sigma Aldrich | A9418-100G | 5% in PBS |
| Hydrophobic Barrier Pap Pen | Scientific Device Laboratory | 9804-02 | |
| Microscope Slides | Globe Scientific | 1358W | |
| Coverglass | Fisher Scientific | 12-544-E | |
| Immumount | Thermo Scientific | 9990402 | |
| Nail Polish | L'Oreal | ||
| Nikon Eclipse TE-200 Inverted Fluorescence and Brightfield Microscope | Discontinued | ||
| SPOT RT/KE | SPOT Imaging Solutions | RT940 | |
| Dell Optiplex | |||
| BA-F8 Primary Antibody | Developmental Studies Hybridoma Bank at the University of Iowa | monoclonal mouse IgG2b; 1:50 | |
| SC-71 Primary Antibody | Developmental Studies Hybridoma Bank at the University of Iowa | monclonal mouse IgG1; 1:50 | |
| BF-F3 Primary Antibody | Developmental Studies Hybridoma Bank at the University of Iowa | monoclonal mouse IgGM; 1:50 | |
| 6H1 Primary Antibody | Developmental Studies Hybridoma Bank at the University of Iowa | monoclonal mouse IgGM; 1:50 | |
| Alexa Fluor 594 anti-IgG2b | Invitrogen | A21145 | goat anti-mouse; 1:200 |
| Alexa Fluor 488 anti-IgG1 | Invitrogen | A21121 | goat anti-mouse;1:200 |
| Alexa Fluor 594 anti-IgGM | Invitrogen | A21044 | goat anti-mouse;1:200 |
| OCT | Sakura Finetek | 4583 | |
| isopentane | Fisher Scientific | O3551-4 | cool with liguid nitrogen |
| PBS | Fisher Bioreagents | BP665-1 | 10X, dilute to 1X |
| Kim wipes | Kimberly-Clark | 06-666A |
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