Fare kas iskelet morfoloji ve Fiber türü kompozisyon yarı otomatik analizi
Summary
İmmunohistokimyasal myosin ağır zincir izoformlarının boyama iskelet kas lif tipi state-of–art ayrıştırıcı çıkmıştır (Yani, tip ı, IIA yazın, yazın IIX, IIB yazın). Burada, bir boyama protokol hızlı fiber türü ve lif morfolojisi değerlendirilmesi kolaylaştırır bir roman yarı otomatik algoritması ile birlikte mevcut.
Abstract
Yıllardır, iskelet kas lif türleri arasında ayrım en iyi myosin-ATPaz boyama tarafından görüntülenmiştir. Daha yakın zamanlarda, immunohistokimyasal myosin ağır zincir (MyHC) izoformlarının boyama fiber türü daha ince bir ayrıştırıcı ortaya çıkmıştır. Tip ı, IIA, IIX yazın yazın ve tip IIB lifleri şimdi onların MyHC profiline dayalı hassasiyetle tespit edilebilir; Ancak, bu verilerin el ile analiz yavaş ve aşağı doğru olabilir sıkıcı. Bu bağlamda, hızlı, doğru değerlendirme fiber türü kompozisyon ve Morfoloji çok arzu edilen bir araçtır. Burada, MyHCs fare hindlimb kas fiber türü ve lif morfolojisi analizini hızlandırır roman yarı otomatik bir algoritma ile uyum içinde elde edilen donmuş bölümlerinde, state-of–art immunohistokimyasal boyama için bir iletişim kuralı mevcut. Beklendiği gibi görüntülenen soleus kas-için boyama tip ı ve tip IIA lifleri, ama türü IIX ya da tip IIB lifleri için değil. Öte yandan, tibialis anterior kas türü IIX ve tip IIB liflerinin, tip IIA lifleri küçük bir kısmını ağırlıklı olarak bestelendi ve az veya hiç tip ı lifleri. Birkaç görüntü dönüşümleri lif morfolojisi (Yani, kesit alanı (CSA), maksimum ve minimum Feret çapı) farklı yönlerini ölçmek amacıyla olasılık haritalar oluşturmak için kullanılan. Bu parametreler sonra el ile elde edilen değerler ile karşılaştırıldı için elde edilen değerler. Hiçbir önemli farklılıklar analiz CSA, maksimum veya minimum Feret çapı açısından her iki mod arasında gözlendi (tüm p > 0,05), bizim yöntem doğruluğunu gösteren. Böylece, bizim immunostaining Çözümleme Protokolü Kas kompozisyonu yaşlanma ve myopathy birçok model üzerinde etkileri incelenmesi için uygulanabilir.
Introduction
Kas iskelet birçok türleri1tek liflerinin oluşan bir süredir bilinmektedir. Başlangıçta, iki grup liflerinin contractile özelliklerine göre karakterize ve adli, uygun şekilde, yavaş seğirme (tip ı) ve hızlı-seğirme (tip II). Bu kategoriler daha fazla lif metabolizma temelinde ayırt edildi. Beri tip ı lifleri mitokondri içinde zengin ve oksidatif metabolizma güvenen, onlar sağlam olumlu Nikotinamid adenin dinükleotit-tetrazolium redüktaz (NADH-TR) diaphorase2 ya da süksinat dehidrogenaz (SDH)3 ile aydınlatılmamıştır boyama. Buna karşılık, tip II lifleri daha az sergilenen ve değişken derece NADH-TR diaphorase veya SDH boyama ve iki fast twitch alt gruplar ayrıldı (IIA ve IIB yazın) biraz kabaca göreli oksidatif kapasite üzerinde dayalı. Bu ayrımlar lifler arasında-var daha etkili bir şekilde görselleştirildiği myosin-ATPaz boyama tarafından nerede tip ı lifleri leke karanlık pH 4.0 öncesi bir kuluçka sonra ve tip IIB lifleri absorbe pH 10.0 tip IIA lifleri ile acele aşağıdaki ön kuluçka ayda4boyama.
Daha yakın zamanlarda, immunohistokimyasal myosin ağır zincir (MyHC) izoformlarının boyama lif tipi5ince bir ayrıştırıcı ortaya çıkmıştır. Tip ı, IIA yazın ve tip IIB lifleri tüm hassasiyetle onların MyHC profiline göre belirlenebilir. Ayrıca, başka bir fast twitch metabolik olarak orta fiber türü, IIX, yazın tanımlanan6oldu. Birden fazla MyHC ifade karma lifler de teyit edilen5,7,8olmuştur. Kedi ve maymun gibi bazı türler değil hızlı Tip IIb MyHCs6için bilinir. MyHC immunostaining Kas kompozisyonu state-of–art değerlendirilmesi şu anda olsa da, bu tekniği ile elde edilen verilerin analizi hantal ve zaman alıcı otomatik yardımı olmadan. Bu amaçla, bu verileri çözümlemek için yarı otomatik yöntemleri bir avuç gelişmiş5,9,10olmuştur. Burada, kas lif tipi5,7,8,10, immunohistokimyasal tanımlanması için nispeten standart bir protokol ile birlikte bir roman yarı otomatik mevcut fiber türü ve lif morfolojisi analizini hassasiyetle hızlandırır algoritması.
Protocol
Representative Results
Discussion
Burada, bizim iskelet kas lif türleri tanımlanması için yararlı yön vermişlerdir. Bunu yaparken, biz veri analizi için yeni bir algoritma tanımlamak.
Bizim sonuçları büyük ölçüde bu önceki raporlar5,8,10 onaylayın ve bizim kendi el ile ölçümleri yansıtmak beri algoritma doğru gibi görünüyor. Yine de, yapı kesit sonucu belirsiz fiber Kenarlıklar dahil olmak üzere bazı nadi…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Boettcher Vakfı ve amyotrofik Lateral skleroz Derneği (#17-II-344) bu araştırma verdikleri destek için minnettarız.
Materials
| Bovine Serum Albumin | Sigma Aldrich | A9418-100G | 5% in PBS |
| Hydrophobic Barrier Pap Pen | Scientific Device Laboratory | 9804-02 | |
| Microscope Slides | Globe Scientific | 1358W | |
| Coverglass | Fisher Scientific | 12-544-E | |
| Immumount | Thermo Scientific | 9990402 | |
| Nail Polish | L'Oreal | ||
| Nikon Eclipse TE-200 Inverted Fluorescence and Brightfield Microscope | Discontinued | ||
| SPOT RT/KE | SPOT Imaging Solutions | RT940 | |
| Dell Optiplex | |||
| BA-F8 Primary Antibody | Developmental Studies Hybridoma Bank at the University of Iowa | monoclonal mouse IgG2b; 1:50 | |
| SC-71 Primary Antibody | Developmental Studies Hybridoma Bank at the University of Iowa | monclonal mouse IgG1; 1:50 | |
| BF-F3 Primary Antibody | Developmental Studies Hybridoma Bank at the University of Iowa | monoclonal mouse IgGM; 1:50 | |
| 6H1 Primary Antibody | Developmental Studies Hybridoma Bank at the University of Iowa | monoclonal mouse IgGM; 1:50 | |
| Alexa Fluor 594 anti-IgG2b | Invitrogen | A21145 | goat anti-mouse; 1:200 |
| Alexa Fluor 488 anti-IgG1 | Invitrogen | A21121 | goat anti-mouse;1:200 |
| Alexa Fluor 594 anti-IgGM | Invitrogen | A21044 | goat anti-mouse;1:200 |
| OCT | Sakura Finetek | 4583 | |
| isopentane | Fisher Scientific | O3551-4 | cool with liguid nitrogen |
| PBS | Fisher Bioreagents | BP665-1 | 10X, dilute to 1X |
| Kim wipes | Kimberly-Clark | 06-666A |
References
- Engel, W. K. The essentiality of histo- and cytochemical studies of skeletal muscle in the investigation of neuromuscular disease. Neurol. 12, 778-784 (1962).
- Dobrowolny, G., et al. Skeletal muscle is a primary target of SOD1G93A-mediated toxicity. Cell Metab. 8, 425-436 (2008).
- Sultana, N., et al. Restricting calcium currents is required for correct fiber type specification in skeletal muscle. Development. 143 (9), 1547-1559 (2016).
- Guth, L., Samaha, F. J. Procedure for the histochemical demonstration of actomyosin ATPase. Exp Neurol. 28 (2), 365-367 (1970).
- Bloemberg, D., Quadrilatero, J. Rapid determination of myosin heavy chain expression in rat, mouse, and human skeletal muscle using multicolor immunofluorescence analysis. PLoS One. 7 (4), (2012).
- Lucas, C. A., Kang, L. H., Hoh, J. F. Monospecific antibodies against the three mammalian fast limb myosin heavy chains. Biochem Biophys Res Commun. 272 (1), 303-308 (2000).
- Lee, C. S., et al. Ca2+ permeation and/or binding to Cav1.1 fine-tunes skeletal muscle Ca2+ signaling to sustain muscle function. Skelet Muscle. 5 (4), (2015).
- Sawano, S., et al. A one-step immunostaining method to visualize rodent muscle fiber type within a single specimen. PLoS One. 11 (11), (2016).
- Meunier, B., Picard, B., Astruc, T., Labas, R. Development of image analysis tool for the classification of muscle fibre type using immunohistochemical staining. Histochem Cell Biol. 134 (3), 307-317 (2010).
- Kammoun, M., Casser-Malek, I., Meunier, B., Picard, B. A simplified immunohistochemical classification of skeletal muscle fibres in mouse. Eur J Histochem. 58 (2), 2254 (2014).
- Kumar, A., Accorsi, A., Rhee, Y., Girgenrath, M. Do’s and don’ts in the preparation of muscle cryosections for histological analysis. J Vis Exp. (99), (2015).
- Schiaffino, S., et al. Three myosin heavy chain isoforms in type 2 skeletal muscle fibres. J Muscle Res Cell Motil. 10 (197), (1989).
- Augusto, V., Padovani, C. R., Campos, G. E. R. Skeletal muscle fiber types in C57Bl6j mice. Braz J Morphol Sci. 21 (2), 89-94 (2004).
- Schiaffino, S., Reggiani, C. Fiber types in mammalian skeletal muscles. Physiol Rev. 91 (4), 1447-1531 (2011).
- Allen, D. L., Harrison, B. C., Maass, A., Bell, M. L., Byrnes, W. C., Leinwand, L. A. Cardiac and skeletal muscle adaptations to voluntary wheel running in the mouse. J Appl Physiol. 90 (5), 1900-1908 (2001).
