Summary

Analyse semi-automatique de souris Muscle squelettique morphologie et la Composition de la fibre de type

Published: August 31, 2017
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Summary

Marquage immunohistochimique des isoformes de la chaîne lourde de myosine a émergé comme le discriminant de l’état-of-the-art des fibres musculaires squelettiques de type (c’est-à-direde type I, type IIA, tapez IIX, type IIB). Nous présentons ici un protocole de coloration avec un nouvel algorithme semi automatisé qui facilite l’évaluation rapide de la morphologie de type fibre et fibre.

Abstract

Pendant des années, distinctions entre les types de fibres musculaires squelettiques ont été mieux visualisées par la souillure de la myosine-ATPase. Plus récemment, la coloration immunohistochimique des isoformes de myosine lourde chaîne (chaîne) a émergé comme un discriminateur plus fin des fibres de type. De type I, type IIA, le type IIX et de fibres de type IIB peuvent être identifiés avec précision selon leur profil de chaîne ; Cependant, l’analyse manuelle de ces données peut être lent et bas-droite fastidieux. À cet égard, une évaluation rapide et précise de la composition de la fibre de type et de la morphologie est un outil très souhaitable. Nous présentons ici un protocole pour une coloration immunohistochimique de l’état-of-the-art de chaînes lourdes de myosine dans les coupes congelées provenant du muscle du membre postérieur souris en concert avec un nouvel algorithme semi-automatisé qui accélère l’analyse de la morphologie de type fibre et fibre. Comme prévu, le muscle soléaire affiche une coloration pour type I et type fibres IIA, mais pas pour les fibres de type IIX ou type IIB. En revanche, le muscle jambier antérieur était essentiellement composé de fibres IIB type IIX et le type, une petite fraction des fibres de type IIA et peu ou pas fibres de type I. Plusieurs transformations d’image ont été utilisées pour générer des cartes de probabilité dans le but de mesurer les différents aspects de la morphologie de la fibre (c.-à-d., section transversale (CSA), diamètre de Feret maximal et minimal). Les valeurs obtenues pour ces paramètres ont ensuite été comparées avec les valeurs obtenues manuellement. Pas de différences significatives ont été observées entre deux modes d’analyse en ce qui concerne les CSA, maximal ou minimal diamètre Feret (tous p > 0,05), indiquant la précision de notre méthode. Ainsi, notre protocole d’analyse immuno-coloration peut être appliquée à l’étude des effets sur la composition de muscle dans de nombreux modèles de vieillissement et de la myopathie.

Introduction

On sait depuis longtemps que le muscle squelettique est composé de fibres isolées de nombreux types1. Au départ, deux groupes de fibres ont été caractérisées selon leurs propriétés contractiles et nommé, convenablement, contraction lente (type I) et rapides (type II). Ces catégories sont distinguent encore sur la base du métabolisme de la fibre. Depuis de type I fibres sont riches en mitochondries et tributaire de métabolisme oxydatif, ils ont été élucidées par robustement positive nicotinamide adénine dinucléotide-tétrazolium réductase (NADH-TR) diaphorase2 ou succinate déshydrogénase (SDH)3 la coloration. En revanche, les fibres de type II exposé moindre et des degrés variables de TR-NADH diaphorase ou SDH coloration et ont été divisés en deux sous-groupes de contraction rapide (types IIA et IIB) un peu grossièrement basée sur leur capacité oxydative relative. Ces distinctions entre les fibres ont été visualisées plus efficacement par la myosine-ATPase coloration où de type I fibres tachent sombres après une pré incubation à pH 4,0 et absorbent les fibres de type IIB précipitée après incubation préalable à pH 10,0 avec des fibres de type IIA la coloration moyennement4.

Plus récemment, la coloration immunohistochimique des isoformes de myosine lourde chaîne (chaîne) a émergé comme un discriminateur plus fin des fibres de type5. De type I, type IIA et les fibres de type IIB peuvent être tous identifiés avec précision selon leur profil de chaîne. En outre, un autre type de contraction rapide métaboliquement intermédiaire fibre, tapez IIX, a été identifié6. Les fibres hybrides exprimant plus d’une chaîne ont également été confirmés5,7,8. Certaines espèces comme le chat et le babouin n’est pas connues de myosine de Type IIB express6. Si la chaîne immunostaining est actuellement à l’évaluation de l’état-of-the-art de la composition du muscle, l’analyse des données obtenues par l’intermédiaire de cette technique est lourd et fastidieux sans aide automatisée. À cette fin, une poignée de méthodes semi-automatisé pour analyser ces données ont été développés5,9,10. Nous présentons ici un protocole relativement standard pour l’identification immunohistochimique des fibres musculaires de type5,7,8,10, avec un roman semi-automatisé algorithme qui accélère l’analyse de la morphologie de type fibre et fibre avec précision.

Protocol

toutes les procédures impliquant des souris ont été approuvés par l’Université du Colorado-Anschutz médicale Campus institutionnels et animalier Comité d’urbanisme (91813(05)1D). 1. jour 1 : primaires (1°) immunomarquage avec blocage Bovine Serum Albumin (BSA) sechage coupes congelées de muscle du membre postérieur de la souris (par exemple, jambier antérieur, muscle soléaire) montés sur des diapositives chargées pour ~ 30 min 11…

Representative Results

Muscles postérieurs (p. ex., jambier antérieur, muscle soléaire), disséqués de souris C57BL/6 mâles d’âge inconnu ont été flash congelés en fonçant un moule en plastique contenant le muscle en OCT composé dans l’isopentane refroidi à l’azote liquide. Puis, coupes sériées de 8-10 µm en utilisant un cryotome, ont été coupés à-20 ° C et transférés à différents verre chargé positivement diapositives12. <p class="jove_content…

Discussion

Ici, nous avons fourni une orientation utile pour l’identification des types de fibres musculaires squelettiques. Ce faisant, les auteurs décrivent un nouvel algorithme pour l’analyse des données.

Étant donné que dans une large mesure, nos résultats confirment ceux des précédents rapports5,8,10 et reflètent nos propres mesures manuelles, l’algorithme semble être précis. Pourtant, nous …

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Nous sommes reconnaissants à la Fondation de Boettcher et l’Association de la sclérose latérale amyotrophique (#17-II-344) pour leur soutien à cette recherche.

Materials

Bovine Serum Albumin Sigma Aldrich A9418-100G 5% in PBS
Hydrophobic Barrier Pap Pen Scientific Device Laboratory 9804-02
Microscope Slides Globe Scientific 1358W
Coverglass Fisher Scientific 12-544-E
Immumount Thermo Scientific 9990402
Nail Polish L'Oreal
Nikon Eclipse TE-200 Inverted Fluorescence and Brightfield Microscope Discontinued
SPOT RT/KE SPOT Imaging Solutions RT940
Dell Optiplex
BA-F8 Primary Antibody Developmental Studies Hybridoma Bank at the University of Iowa monoclonal mouse IgG2b; 1:50
SC-71 Primary Antibody Developmental Studies Hybridoma Bank at the University of Iowa monclonal mouse IgG1; 1:50
BF-F3 Primary Antibody Developmental Studies Hybridoma Bank at the University of Iowa monoclonal mouse IgGM; 1:50
6H1 Primary Antibody Developmental Studies Hybridoma Bank at the University of Iowa monoclonal mouse IgGM; 1:50
Alexa Fluor 594 anti-IgG2b Invitrogen A21145 goat anti-mouse; 1:200
Alexa Fluor 488 anti-IgG1 Invitrogen A21121 goat anti-mouse;1:200
Alexa Fluor 594 anti-IgGM Invitrogen A21044 goat anti-mouse;1:200
OCT Sakura Finetek 4583
isopentane Fisher Scientific O3551-4 cool with liguid nitrogen
PBS Fisher Bioreagents BP665-1 10X, dilute to 1X
Kim wipes Kimberly-Clark 06-666A

References

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Tyagi, S., Beqollari, D., Lee, C. S., Walker, L. A., Bannister, R. A. Semi-automated Analysis of Mouse Skeletal Muscle Morphology and Fiber-type Composition. J. Vis. Exp. (126), e56024, doi:10.3791/56024 (2017).

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