Semi automatizados de análise da morfologia do músculo esquelético de rato e composição de fibra-tipo
Summary
Coloração imuno-histoquímica de isoformas de cadeia pesada de miosina emergiu como o discriminador de estado-da-arte do tipo de fibra muscular esquelético (ou seja, tipo I, tipo IIA, tipo IIX, tipo IIB). Aqui, apresentamos um protocolo de coloração juntamente com um algoritmo semi-automático de romance que facilita a rápida avaliação da morfologia do tipo de fibra e fibra.
Abstract
Durante anos, distinções entre os tipos de fibra de músculo esquelético foram melhor visualizadas pela coloração de miosina-ATPase. Mais recentemente, coloração imuno-histoquímica de isoformas de miosina pesada corrente (MyHC) tem emergido como um discriminador mais fino do tipo de fibra. Tipo I, tipo IIA, IIX e tipo IIB fibras agora podem ser identificadas com precisão, com base no seu perfil de MyHC; no entanto, a análise manual desses dados pode ser lento e baixo-direita tedioso. A este respeito, avaliação rápida, exata da composição da fibra-tipo e morfologia é uma ferramenta muito desejável. Aqui, apresentamos um protocolo para coloração imuno-histoquímica estado-da-arte da MyHCs nas seções congeladas obtidas de músculo do membro posterior do mouse em conjunto com um algoritmo semi-automático de romance que acelera a análise da morfologia do tipo de fibra e fibra. Como esperado, o músculo sóleo exibido mancha para tipo I e fibras IIA, mas não para as fibras tipo IIX ou tipo IIB. Por outro lado, o músculo tibial anterior era composto predominantemente de tipo IIX e tipo IIB fibras, uma pequena fração de fibras de tipo IIA e pouco ou nenhum tipo I fibras. Várias transformações de imagem foram utilizadas para gerar mapas de probabilidade, com a finalidade de medir os diferentes aspectos da morfologia das fibras (ou seja, área da seção transversal (CSA), diâmetro de Feret máxima e mínima). Os valores obtidos para estes parâmetros foram então comparados com os valores obtidos manualmente. Não há diferenças significativas foram observadas entre o modo de análise em relação ao CSA, diâmetro de Feret máximo ou mínimo (todos os p > 0,05), indicando a precisão do nosso método. Assim, nosso protocolo de análise de imunocoloração pode ser aplicado para a investigação dos efeitos na composição muscular em muitos modelos de envelhecimento e miopatia.
Introduction
-Já há algum tempo que o músculo esquelético é composto por fibras simples de muitos tipos1. Inicialmente, dois grupos de fibras foram caracterizados com base em suas propriedades contráteis e chamado, apropriadamente, contração lenta (tipo I) e contração rápida (tipo II). Estas categorias eram ainda mais diferenciadas com base no metabolismo de fibra. Desde tipo I fibras são ricas em mitocôndrias e dependente do metabolismo oxidativo, eles foram elucidados por robustamente positivo dinucleótido de nicotinamida e adenina-tetrazólio redutase (NADH-TR) face2 ou Succinato desidrogenase (SDH)3 a coloração. Por outro lado, as fibras do tipo II exibiram menor e graus variáveis de NADH-TR face ou SDH manchando e foram divididos em dois subgrupos de contração rápida (tipo IIA e IIB) um pouco grosseira com base na sua capacidade oxidativa relativa. Essas distinções entre fibras tem sido visualizadas mais eficazmente pela miosina-ATPase coloração onde tipo I fibras mancham escuras depois de uma pré-incubação a pH 4.0 e tipo IIB fibras absorvem precipitada seguir pré-incubação com fibras de tipo IIA pH 10,0 coloração intermediària4.
Mais recentemente, coloração imuno-histoquímica de isoformas de miosina pesada corrente (MyHC) tem emergido como um discriminador mais fino de fibra-tipo5. Tipo I, tipo IIA e tipo IIB fibras podem ser todos identificadas com precisão com base no seu perfil MyHC. Além disso, um outro tipo de rápido-contração muscular metabolicamente intermediário-fibra, tipo IIX, tem sido identificados6. Fibras de híbrido expressar mais do que um MyHC também foram confirmados5,7,8. Algumas espécies como o gato e o babuíno são conhecidos para não expresso tipo IIB MyHCs6. Apesar de imunocoloração MyHC atualmente é a avaliação do estado-da-arte da composição muscular, a análise dos dados obtidos através desta técnica é complicado e demorado sem assistência automatizada. Para este fim, um punhado de métodos semi automatizados para analisar esses dados foram desenvolvidos5,9,10. Aqui, apresentamos um protocolo relativamente padrão para identificação de imuno-histoquímica de fibra muscular tipo5,7,8,10, , juntamente com um romance semi-automático algoritmo que acelera a análise da morfologia do tipo de fibra e fibra com precisão.
Protocol
Representative Results
Discussion
Aqui, nós fornecemos orientação útil para a identificação dos tipos de fibra de músculo esquelético. Ao fazê-lo, descrevemos um novo algoritmo para análise dos dados.
Desde que nossos resultados, em grande parte, confirmam os anteriores relatórios5,8,10 e refletem nossa própria medição manual, o algoritmo aparece ser exato. Ainda, encontramos algumas armadilhas experimentais infrequentes…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Estamos gratos à Fundação Boettcher e a associação de esclerose Lateral amiotrófica (#17-II-344) pelo apoio da pesquisa.
Materials
| Bovine Serum Albumin | Sigma Aldrich | A9418-100G | 5% in PBS |
| Hydrophobic Barrier Pap Pen | Scientific Device Laboratory | 9804-02 | |
| Microscope Slides | Globe Scientific | 1358W | |
| Coverglass | Fisher Scientific | 12-544-E | |
| Immumount | Thermo Scientific | 9990402 | |
| Nail Polish | L'Oreal | ||
| Nikon Eclipse TE-200 Inverted Fluorescence and Brightfield Microscope | Discontinued | ||
| SPOT RT/KE | SPOT Imaging Solutions | RT940 | |
| Dell Optiplex | |||
| BA-F8 Primary Antibody | Developmental Studies Hybridoma Bank at the University of Iowa | monoclonal mouse IgG2b; 1:50 | |
| SC-71 Primary Antibody | Developmental Studies Hybridoma Bank at the University of Iowa | monclonal mouse IgG1; 1:50 | |
| BF-F3 Primary Antibody | Developmental Studies Hybridoma Bank at the University of Iowa | monoclonal mouse IgGM; 1:50 | |
| 6H1 Primary Antibody | Developmental Studies Hybridoma Bank at the University of Iowa | monoclonal mouse IgGM; 1:50 | |
| Alexa Fluor 594 anti-IgG2b | Invitrogen | A21145 | goat anti-mouse; 1:200 |
| Alexa Fluor 488 anti-IgG1 | Invitrogen | A21121 | goat anti-mouse;1:200 |
| Alexa Fluor 594 anti-IgGM | Invitrogen | A21044 | goat anti-mouse;1:200 |
| OCT | Sakura Finetek | 4583 | |
| isopentane | Fisher Scientific | O3551-4 | cool with liguid nitrogen |
| PBS | Fisher Bioreagents | BP665-1 | 10X, dilute to 1X |
| Kim wipes | Kimberly-Clark | 06-666A |
References
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