Samling af efter parring sæd fra den kvindelige forplantningsorganerne og målingen af sæd fortætning i mus
Summary
Sæd flydendegørelse kræves for sæd for at blive befriet fra den skelsættende gel. Denne undersøgelse indeholder procedurer for indsamling af sæd fra den kvindelige forplantningsorganerne efter coitus, og måling af sæd flydendegørelse tid.
Abstract
I mus, er udbrød sæd deponeret i livmoderen. Efter ejakulation, sæden ændrer konsistens fra gel-lignende til rindende, en proces kaldet fortætning. I denne undersøgelse viser vi hvordan man skal indsamle post udbrød sæd fra den kvindelige forplantningsorganerne i en musemodel. Første, voksne hunmus i estrus scenen har været opstaldet i en mandlig bur natten over. Den næste morgen, blev samleje bekræftet ved tilstedeværelsen af copulatory plug på vaginal åbning. Hunmus med copulatory stik blev aflivet, og hver forplantningsorganerne blev indsamlet som helhed (vagina, livmoderen, æggelederne, æggestokkene), at sikre et lukket system til at indeholde sæd. Forplantningsorganerne blev placeret i en 1,5 mL microcentrifuge rør, og skeden var afskåret for at frigive sæden ind i røret. For at sikre maksimal sædmængde for analyse, blev tandløs pincet brugt til at presse de uterine horn fra æggestokkene ende til vaginal ende udvisning resterende sæd. Hele forplantningsorganerne blev derefter kasseres. Sæd-holdige røret var kortvarigt spundet ned. 25 μL kapillær pipette blev sat ind i røret i en 180° vinkel (parallel til rørvæggen). Mængden af tid, der bruges til at fylde kapillarrør til linjen 25 μL blev indspillet. Sæd fra et gennemprøvet mandlige opdrætter tager normalt ca. 60-180 s til at fylde en 25 μL kapillarrør. Denne sæd samling teknik kan også bruges i andre downstream applikationer såsom billedbehandling og motilitet sædanalyse.
Introduction
Den kvindelige forplantningsorganerne består af de øvre og nedre skrifter. Den øverste forplantningsorganerne omfatter æggelederne, livmoderen og endocervix. Den lavere forplantningsorganerne omfatter ectocervix og skeden. Hos mennesker, er udbrød sæd deponeret på den forreste væg af skeden, støder op til ectocervix1. I mus, dog er sæden fejet ind i livmoderen inden for minutter efter parring2.
Sæd indeholder skelsættende gel, der er størknet inden for sekunder efter ejakulation, forårsager sperm at blive fanget og immobiliseret3. Flydendegørelse frigiver immobiliseret sæd ved at ændre sæd fra en gel-lignende til en vandig konsistens. Denne proces er afgørende for sperm motilitet og pattedyr reproduktion. Viden om sæd flydendegørelse er hovedsagelig baseret på in vitro- undersøgelser hvor sæd bliver flydende i en kultur parabol. Hos mennesker er den enzymatiske aktivitet af prostata specifikt antigen eller PSA (også kendt som kallikrein-relaterede peptidase 3 eller KLK3) den største bidragyder til flydendegørelse gennem hydrolyse af semenogelins (gel-dannende proteiner til stede i sædvæsken)4 ,5,6. Nedbrydning af semenogelins frigiver sæd fra den skelsættende koagel, øge sperm mobilitet. Frigjort sædceller svømme mod æggelederen til at befrugte ægget. Fortætning (eller sæd viskositet) test er en af de standard indledende screeninger for sædanalyse i fertilitetsklinikker at vurdere mandlige fertilitet7.
En nyligt offentliggjort artikel viser, at analyse af skelsættende væske indsamlet fra den kvindelige mus forplantningsorganerne efter parring kan bruges til at illustrere en mangel ved fortætning, der efterfølgende kan forårsage frugtbarhed defekter8. Defekte flydendegørelse såsom sæd Hyperviskositet bidrager til 11,8-32.3% af ufrugtbar sager i mænd9, tyder på, at normale flydendegørelse er uundværlig for pattedyr reproduktion. Men, undersøgelser og behandling af flydendegørelse defekter har fokuseret udelukkende på den mandlige7. Muligheden for, at den kvindelige forplantningsorganerne spiller en rolle i sæd flydendegørelse er ikke blevet undersøgt. Metoder til tyrestationer og måling af flydendegørelse tid vil derfor tildele forskere en roman diagnostisk redskab for at afgøre, om flydendegørelse kunne være en af årsagerne til infertilitet hos model organisme af interesse.
Protocol
Representative Results
Discussion
Indsamling af sæd fra mus livmoder kan give fordele over sæd analyse in vitro- som den tidligere kan illustrere fysiologiske samspillet mellem sæd og sekret fra den kvindelige forplantningsorganerne. De teknikker præsenteret i denne undersøgelse giver forskere til at bestemme sædkvalitet samt sæd levedygtighed og motilitet under ideelle fysiologiske forhold. Desuden er der forskellige downstream analyser, der kan udføres ved hjælp af sæd opsamlet fra livmoder, for eksempel sæden kan regnes fo…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbejde støttes af kollegium af veterinærmedicin (WSU) start-up fonden til WW. Forfatterne takke Sierra Olsen (WSU) for kritisk læsning af dette manuskript.
Materials
| Toothpick | Diamond | 750-Flat | Autoclaved sterile, use blunted toothpick. Do not use point-ended |
| Dissecting scissors | Fisher | 08-940 | |
| Spring scissors | Roboz | RS-5600 | |
| Fine forceps | Roboz | RS-5045 | |
| 25-μL glass capillary tube | VWR | 53432-761 | |
| Leibovitz’s L-15 media | Life Technologies | 11415064 | Supplement with 1% FBS |
| Fetal bovine serum (FBS) | Gemini Bio-Products | 100-106 | |
| 1.5-mL microcentrifuge tube | Axygen | MCT-150-C | |
| 2-mL microcentrifuge tube | Axygen | MCT-200-A | |
| Digital dry block heater | VWR | 13259-052 | For warming the microcentrifuge tube prior to semen collection |
| Minicentrifuge | Corning | LSE 6765 | |
| 35-mm culture dish | VWR | 10861-656 | |
| 15-mL polypropylene centrifuge tube | VWR | 10025-686 | |
| Waterbath | Precision | TSGP05 | |
| Heated stage stereomicroscope | Leica Microsystems | MZ10F | To keep the tissue warm prior to semen collection |
| Brightfield microscope | Leica Microsystems | DMi8 | Optional. For video imaging of the sperm motility |
| Camera | Leica Microsystems | DMC2900 | Optional. For video imaging of the sperm motility |
| Glass slides | Fisher | 12-552-3 | Optional. For video imaging of the sperm motility |
| Coverslip | VWR | 48393-059 | Optional. For video imaging of the sperm motility |
| Bleach | Dilute in dH2O to 10% concentration |
References
- Suarez, S. S., Pacey, A. A. Sperm transport in the female reproductive tract. Hum Reprod Update. 12 (1), 23-37 (2006).
- Bedford, J. M., Yanagimachi, R. Initiation of sperm motility after mating in the rat and hamster. J Androl. 13 (5), 444-449 (1992).
- Lilja, H. Cell biology of semenogelin. Andrologia. 22 Suppl 1, 132-141 (1990).
- Lilja, H., Abrahamsson, P. A., Lundwall, A. Semenogelin, the predominant protein in human semen. Primary structure and identification of closely related proteins in the male accessory sex glands and on the spermatozoa. J Biol Chem. 264 (3), 1894-1900 (1989).
- Veveris-Lowe, T. L., Kruger, S. J., Walsh, T., Gardiner, R. A., Clements, J. A. Seminal fluid characterization for male fertility and prostate cancer: kallikrein-related serine proteases and whole proteome approaches. Semin Thromb Hemost. (33), 87-99 (2007).
- Emami, N., Deperthes, D., Malm, J., Diamandis, E. P. Major role of human KLK14 in seminal clot liquefaction. J Biol Chem. 283 (28), 19561-19569 (2008).
- Gerhard, I., Roth, B., Eggert-Kruse, W., Runnebaum, B. Effects of kallikrein on sperm motility, capillary tube test, and pregnancy rate in an AIH program. Arch Androl. 24 (2), 129-145 (1990).
- Li, S., Garcia, M., Gewiss, R. L., Winuthayanon, W. Crucial role of estrogen for the mammalian female in regulating semen coagulation and liquefaction in vivo. PLoS Genet. 13 (4), e1006743 (2017).
- Elia, J., et al. Human semen hyperviscosity: prevalence, pathogenesis and therapeutic aspects. Asian J Androl. 11 (5), 609-615 (2009).
- Winuthayanon, W., Hewitt, S. C., Orvis, G. D., Behringer, R. R., Korach, K. S. Uterine epithelial estrogen receptor alpha is dispensable for proliferation but essential for complete biological and biochemical responses. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (45), 19272-19277 (2010).
- McLean, A. C., Valenzuela, N., Fai, S., Bennett, S. A. Performing vaginal lavage, crystal violet staining, and vaginal cytological evaluation for mouse estrous cycle staging identification. J Vis Exp. (67), e4389 (2012).
- JoVE Science Education Database. Lab Animal Research. Fundamentals of Breeding and Weaning. JoVE. , (2017).
- Prassas, I., Eissa, A., Poda, G., Diamandis, E. P. Unleashing the therapeutic potential of human kallikrein-related serine proteases. Nat Rev Drug Discov. 14 (3), 183-202 (2015).
- Muytjens, C. M., Vasiliou, S. K., Oikonomopoulou, K., Prassas, I., Diamandis, E. P. Putative functions of tissue kallikrein-related peptidases in vaginal fluid. Nat Rev Urol. 13 (10), 596-607 (2016).
