Coleção de pós acasalamento sêmen do trato reprodutivo feminino e medição de liquefação do sêmen em ratos
Summary
Liquefação do sêmen é necessária para que o esperma ser libertado do gel seminal. Este estudo fornece os procedimentos para a recolha de sémen de coito de pós o trato reprodutivo feminino e medir o tempo de liquefação do sêmen.
Abstract
Em camundongos, ejaculou esperma é depositada no útero. Após a ejaculação, o sémen altera a consistência de gel-like para aguado, um processo chamado de liquefação. Neste estudo, mostramos como coletar o sêmen pós-ejaculou do tracto reprodutivo feminino em um modelo do rato. Primeiros, adultos ratos fêmeas na fase de estro foram alojados em jaula de um macho durante a noite. Na manhã seguinte, cópula foi confirmada pela presença de imperatividade plug na abertura vaginal. Camundongos fêmeas com plugues copulativo foram sacrificados, e cada trato reprodutivo foi coletado como um todo (vagina, útero, ovidutos, ovários), assegurando um sistema fechado para conter o sêmen. O trato reprodutivo foi colocado em um tubo de microcentrifugadora de 1,5 mL, e a vagina foi cortada para liberar o sêmen para dentro do tubo. Para garantir o volume de sêmen máxima para análise, pinças desdentadas foram usadas para espremer os cornos uterinos de extremidade ovariana vaginal fim expelir sémen restante. Tracto reprodutivo então foi Descartado. O tubo contendo sêmen brevemente foi girado para baixo. Uma pipeta capilar 25 μL foi colocada dentro do tubo em um ângulo de 180° (paralela à parede do tubo). A quantidade de tempo usado para encher o tubo capilar à linha 25 μL foi gravada. Sêmen de um reprodutor masculino comprovado normalmente leva cerca de 60-180 s para encher um tubo capilar de 25 μL. Esta técnica de coleta de sêmen também pode ser usada em outras aplicações a jusante, tais como análise de imagens e motilidade do esperma.
Introduction
Aparelho reprodutor feminino é composto pelo trato superior e inferior. O trato reprodutivo superior inclui trompas de Falópio, o útero e o endocérvice. O trato reprodutivo inferior inclui o ectocérvice e a vagina. Em humanos, ejaculou sêmen é depositado na parede anterior da vagina, adjacente à ectocérvice1. Em camundongos, entretanto, o sémen é arrastado para o útero dentro de minutos após o acasalamento de2.
Sêmen contém gel seminal que é solidificado em segundos da ejaculação, fazendo com que o esperma a ser aprisionado e imobilizada3. Liquefação libera o esperma imobilizado, alterando o sêmen de um gel-like para uma consistência aquosa. Este processo é essencial para a mobilidade do esperma e a reprodução dos mamíferos. Conhecimento de liquefação do sêmen baseia-se principalmente em vitro estudos onde o sêmen torna-se liquefeito em um prato de cultura. Em humanos, a atividade enzimática de antígeno prostático específico ou PSA (também conhecido como calicreína-relacionados peptidase 3 ou KLK3) é o principal contribuinte para liquefação por hidrólise de semenogelins (formação de gel de proteínas presentes no sêmen)4 ,5,6. Degradação de semenogelins libera o esperma da hemostase seminal, aumentando a mobilidade do esperma. Libertou o esperma nadar em direção de Falópio para fecundar o óvulo. Liquefação (ou viscosidade do sêmen) testes são uma das sessões iniciais padrão para análise de sêmen em clínicas de fertilidade para avaliar a fertilidade masculina7.
Um artigo recentemente publicado mostra que a análise do fluido seminal coletado do rato fêmea trato reprodutivo pós acasalamento pode ser usada para ilustrar uma deficiência na liquefação que posteriormente pode causar defeitos de fertilidade8. Liquefação defeituosa como sémen hiperviscosidade contribui para 11,8-32,3% dos casos inférteis em homens9, sugerindo que a liquefação normal é indispensável para a reprodução dos mamíferos. No entanto, estudos e tratamento de defeitos de liquefação têm-se centrado exclusivamente no masculino7. Não tem sido explorada a possibilidade de que o trato reprodutivo feminino desempenha um papel na liquefação do sêmen. Portanto, os métodos de colheita de sémen e medir o tempo de liquefação fornecerá pesquisadores uma nova ferramenta de diagnóstica para determinar se a liquefação pode ser uma das causas de infertilidade no organismo modelo de interesse.
Protocol
Representative Results
Discussion
Coleta de sêmen de úteros de rato pode fornecer vantagens sobre sêmen análise em vitro , como o antigo pode ilustrar as interações fisiológicas entre o esperma e as secreções do tracto reprodutivo feminino. As técnicas apresentadas neste estudo permitem aos investigadores determinar a qualidade do sêmen, bem como a viabilidade do esperma e a mobilidade em condições fisiológicas ideais. Além disso, existem várias análises a jusante que podem ser executadas usando o sêmen coletado o úte…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho é apoiado pelo fundo de start-up de faculdade de medicina veterinária (WSU) para WW. Os autores agradecer Sierra Olsen (WSU) para leitura crítica deste manuscrito.
Materials
| Toothpick | Diamond | 750-Flat | Autoclaved sterile, use blunted toothpick. Do not use point-ended |
| Dissecting scissors | Fisher | 08-940 | |
| Spring scissors | Roboz | RS-5600 | |
| Fine forceps | Roboz | RS-5045 | |
| 25-μL glass capillary tube | VWR | 53432-761 | |
| Leibovitz’s L-15 media | Life Technologies | 11415064 | Supplement with 1% FBS |
| Fetal bovine serum (FBS) | Gemini Bio-Products | 100-106 | |
| 1.5-mL microcentrifuge tube | Axygen | MCT-150-C | |
| 2-mL microcentrifuge tube | Axygen | MCT-200-A | |
| Digital dry block heater | VWR | 13259-052 | For warming the microcentrifuge tube prior to semen collection |
| Minicentrifuge | Corning | LSE 6765 | |
| 35-mm culture dish | VWR | 10861-656 | |
| 15-mL polypropylene centrifuge tube | VWR | 10025-686 | |
| Waterbath | Precision | TSGP05 | |
| Heated stage stereomicroscope | Leica Microsystems | MZ10F | To keep the tissue warm prior to semen collection |
| Brightfield microscope | Leica Microsystems | DMi8 | Optional. For video imaging of the sperm motility |
| Camera | Leica Microsystems | DMC2900 | Optional. For video imaging of the sperm motility |
| Glass slides | Fisher | 12-552-3 | Optional. For video imaging of the sperm motility |
| Coverslip | VWR | 48393-059 | Optional. For video imaging of the sperm motility |
| Bleach | Dilute in dH2O to 10% concentration |
References
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