Colección de postnupcial Semen del aparato reproductor femenino y las mediciones de licuefacción del Semen en ratones
Summary
Licuefacción del semen es necesario para liberarse del gel seminal de los espermatozoides. Este estudio proporciona los procedimientos para la recogida de semen del coito posterior al tracto reproductor femenino y medir el tiempo de licuefacción del semen.
Abstract
En ratones, el eyaculado se deposita en el útero. Después de la eyaculación, el semen cambia de consistencia de gel-como acuosa, un proceso llamado licuefacción. En este estudio, se muestra cómo recoger el post eyaculado en el aparato reproductor femenino en un modelo murino. Ratones hembra en primer lugar, adulto en la etapa de estro se alojaron en la jaula del macho durante la noche. A la mañana siguiente, la cópula fue confirmada por la presencia de copula tapón en la abertura vaginal. Ratones hembra con enchufes copulador fueron sacrificados, y cada tracto reproductivo fue recogido como un todo (vagina, útero, oviductos, ovarios), asegurando un sistema cerrado para contener el semen. El tracto reproductivo fue colocado en un tubo de microcentrífuga de 1,5 mL, y la vagina fue cortada para liberar el semen en el tubo. Para asegurar el volumen de semen máximo para el análisis, pinzas sin dientes se utilizan para exprimir los cuernos uterinos del extremo ovárico al extremo vaginal expulsando el semen restante. El tracto reproductivo entero luego fue descartado. El tubo que contiene el semen brevemente fue hecho girar hacia abajo. Una pipeta capilar de 25 μL se colocó en el tubo en un ángulo de 180 º (paralelo a la pared del tubo). Se registró la cantidad de tiempo usada para llenar el tubo capilar hasta la 25 μL. Semen de un criador macho probado generalmente toma aproximadamente 60-180 s para llenar un tubo capilar de 25 μL. Esta técnica de recogida de semen también puede ser utilizada en otras aplicaciones posteriores como el análisis de la proyección de imagen y de la motilidad de esperma.
Introduction
El tracto reproductor femenino se compone de los tractos superiores e inferiores. El tracto reproductivo superior incluye las trompas de Falopio, el útero y el endocervix. El tracto reproductivo inferior incluye el exocérvix y la vagina. En los seres humanos, el eyaculado se deposita en la pared anterior de la vagina, junto al ectocérvix1. En ratones, sin embargo, el semen se barre en el útero dentro de minutos después del acoplamiento2.
Semen contiene gel seminal que se solidifica dentro de segundos de la eyaculación, causando el esperma para ser atrapados e inmovilizados3. Licuefacción libera el esperma inmovilizado cambiando semen de un tipo de gel con una consistencia acuosa. Este proceso es esencial para la motilidad espermática y la reproducción mamífera. Conocimiento de licuefacción del semen se basa sobre todo en vitro estudios donde se convierte en licuado de semen en una placa de cultivo. En los seres humanos, la actividad enzimática del antígeno prostático específico o PSA (peptidasa también conocido como relacionadas con la calicreína 3 o KLK3) es el principal para la licuefacción a través hidrólisis de semenogelins (gelificante proteínas presentes en el semen)4 ,5,6. Degradación de semenogelins libera el esperma del coágulo seminal, aumento de la movilidad del esperma. Liberado el nado de espermatozoides hacia la trompa de Falopio para fertilizar el huevo. Licuefacción (o viscosidad del semen) las pruebas son una de las proyecciones iniciales estándar para el análisis de semen en las clínicas de fertilidad para evaluar la fertilidad masculina7.
Un artículo recientemente publicado muestra que se pueden usar análisis de fluido seminal de la hembra del ratón tracto reproductivo postnupcial para ilustrar una deficiencia en licuefacción que posteriormente puede causar fertilidad defectos8. Licuefacción defectuoso como semen hiperviscosidad contribuye a 11.8 32.3% de los casos estériles en hombres9, sugiriendo que la licuefacción normal es indispensable para la reproducción de mamífero. Sin embargo, estudios y tratamiento de los defectos de licuefacción se han centrado exclusivamente en el hombre7. No se ha explorado la posibilidad de que el tracto reproductor femenino desempeña un papel en la licuefacción del semen. Por lo tanto, los métodos de colección de semen y medir el tiempo de licuefacción proporcionará a los investigadores una nueva herramienta de diagnóstico para determinar si la licuefacción puede ser una de las causas de la infertilidad en el organismo modelo de interés.
Protocol
Representative Results
Discussion
Recogida de semen de úteros de ratón puede proporcionar ventajas sobre el análisis de semen en vitro como la anterior puede ilustrar las interacciones fisiológicas entre el semen y las secreciones del tracto reproductivo femenino. Las técnicas presentadas en este estudio permiten a los investigadores a determinar la calidad del semen así como viabilidad espermática y la motilidad en condiciones fisiológicas ideales. Además, hay varios análisis posteriores que se pueden realizar utilizando el e…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo es apoyado por el fondo de puesta en marcha de Universidad de medicina veterinaria (WSU) a WW. Los autores agradecen Sierra Olsen (WSU) la lectura crítica de este manuscrito.
Materials
| Toothpick | Diamond | 750-Flat | Autoclaved sterile, use blunted toothpick. Do not use point-ended |
| Dissecting scissors | Fisher | 08-940 | |
| Spring scissors | Roboz | RS-5600 | |
| Fine forceps | Roboz | RS-5045 | |
| 25-μL glass capillary tube | VWR | 53432-761 | |
| Leibovitz’s L-15 media | Life Technologies | 11415064 | Supplement with 1% FBS |
| Fetal bovine serum (FBS) | Gemini Bio-Products | 100-106 | |
| 1.5-mL microcentrifuge tube | Axygen | MCT-150-C | |
| 2-mL microcentrifuge tube | Axygen | MCT-200-A | |
| Digital dry block heater | VWR | 13259-052 | For warming the microcentrifuge tube prior to semen collection |
| Minicentrifuge | Corning | LSE 6765 | |
| 35-mm culture dish | VWR | 10861-656 | |
| 15-mL polypropylene centrifuge tube | VWR | 10025-686 | |
| Waterbath | Precision | TSGP05 | |
| Heated stage stereomicroscope | Leica Microsystems | MZ10F | To keep the tissue warm prior to semen collection |
| Brightfield microscope | Leica Microsystems | DMi8 | Optional. For video imaging of the sperm motility |
| Camera | Leica Microsystems | DMC2900 | Optional. For video imaging of the sperm motility |
| Glass slides | Fisher | 12-552-3 | Optional. For video imaging of the sperm motility |
| Coverslip | VWR | 48393-059 | Optional. For video imaging of the sperm motility |
| Bleach | Dilute in dH2O to 10% concentration |
References
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