Коллекции после спаривания спермы от женского репродуктивного тракта и измерение сжижения спермы мышей
Summary
Семен сжижения необходим для спермы, чтобы освободиться от семенных геля. Это исследование содержит процедуры для сбора спермы от женского репродуктивного тракта после полового акта и Семен сжижения время измерения.
Abstract
В мышей которое преодолевает эякулированное семя осаждается в матке. После эякуляции, Семен изменяет последовательность с гель как водянистые, процесс называется сжижение. В этом исследовании мы покажем, как собрать после которое преодолевает эякулированное семя от женского репродуктивного тракта в мышиной модели. Во-первых, взрослых самок мышей в стадии эструса были размещены в клетке мужчина на ночь. Следующим утром, совокупление было подтверждено наличие копулятивного вилку на влагалище. Самок мышей с копулятивного вилки были умерщвлены, и каждый репродуктивного тракта была собрана в целом (влагалища, матки, яйцеводов, яичников), обеспечение закрытой системы содержат спермы. Репродуктивного тракта был помещен в пробки microcentrifuge 1,5 мл, и влагалища был отрезан выпустить спермы в трубу. Для обеспечения максимальной спермы тома для анализа, беззубый щипцы были использованы для выжать матки рога из яичников конца для вагинального конца изгнания оставшихся спермы. Весь репродуктивного тракта был затем отбрасывается. Семен содержащих трубки был кратко вращаться вниз. 25 мкл капиллярной пипеткой был помещен в трубу под углом 180° (параллельно стенкам трубки). Количество времени, используемый для заполнения капиллярную трубку к линии 25 мкл был записан. Сперма из проверенных мужской заводчик обычно занимает около 60-180 s для заполнения 25 мкл капиллярной трубки. Этот метод сбора спермы может также использоваться в других нисходящие приложения, такие как анализ изображений и подвижности спермы.
Introduction
Женского репродуктивного тракта состоит из верхней и нижних участков. Верхняя репродуктивного тракта включает фаллопиевы трубы, матка и эндоцервикса. Нижняя репродуктивного тракта включает в себя ectocervix и влагалище. В организме человека которое преодолевает эякулированное семя осаждается на передней стенке влагалища, прилегающих к ectocervix1. В мышей однако, Семен заметен в полость матки в течение нескольких минут после спаривания2.
Семен содержатся семенных гель, который затвердевает в течение нескольких секунд семяизвержение, вызывая спермы, чтобы быть в ловушке и иммобилизованные3. Сжижение выпускает подвижности сперматозоидов, изменив спермы с гель как к водянистой консистенцией. Этот процесс имеет важное значение для сперматозоидов и mammalian воспроизведение. Знание Семен сжижения основана главным образом на в vitro исследования где спермы становится сжиженные в культуры блюдо. В организме человека Ферментативная активность Простатоспецифический антиген или PSA (также известный как калликреин связанных пептидаза 3 или KLK3) является основным донором для разжижения путем гидролиза semenogelins (гелеобразующий белков, присутствующих в сперме)4 ,5,6. Деградации semenogelins освобождает спермы от семенных сгусток, увеличение подвижности сперматозоидов. Освободил спермы плавать к маточной трубе, чтобы оплодотворить яйцеклетку. Сжижение (или вязкость спермы) тесты являются одним из стандартных первоначальный показы для анализа спермы в рождаемость клиники для оценки фертильности мужчин7.
Недавно опубликованные статьи показывает, что анализ семенной жидкости, собранные от репродуктивного тракта женский мыши после спаривания может использоваться для иллюстрации дефицит сжижения, которые впоследствии могут вызвать плодородие дефекты8. Дефектные разжижения таких Семен повышенной способствует 11,8-32,3% случаев бесплодных мужчин9, о том, что нормальный сжижения незаменимым для млекопитающих размножения. Однако исследования и лечения дефектов сжижения были сосредоточены исключительно на мужчин7. Возможность, что женского репродуктивного тракта играет определенную роль в Семен сжижения не изучены. Таким образом методы для сбора спермы и сжижение время измерения обеспечит исследователи романа диагностический инструмент для определения ли сжижения может быть одной из причин бесплодия в организме модель интерес.
Protocol
Representative Results
Discussion
Сбор спермы от мыши матки может предоставить преимущества над Семен анализ в пробирке , как первый можно проиллюстрировать физиологические взаимодействий между спермы и выделениями из женского репродуктивного тракта. Методы, представленные в настоящем исследовании позволя…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа поддерживается Фондом Колледжа ветеринарной медицины (WSU) запуска для WW. Авторы благодарят Сьерра Олсен (WSU) для критических чтении этой рукописи.
Materials
| Toothpick | Diamond | 750-Flat | Autoclaved sterile, use blunted toothpick. Do not use point-ended |
| Dissecting scissors | Fisher | 08-940 | |
| Spring scissors | Roboz | RS-5600 | |
| Fine forceps | Roboz | RS-5045 | |
| 25-μL glass capillary tube | VWR | 53432-761 | |
| Leibovitz’s L-15 media | Life Technologies | 11415064 | Supplement with 1% FBS |
| Fetal bovine serum (FBS) | Gemini Bio-Products | 100-106 | |
| 1.5-mL microcentrifuge tube | Axygen | MCT-150-C | |
| 2-mL microcentrifuge tube | Axygen | MCT-200-A | |
| Digital dry block heater | VWR | 13259-052 | For warming the microcentrifuge tube prior to semen collection |
| Minicentrifuge | Corning | LSE 6765 | |
| 35-mm culture dish | VWR | 10861-656 | |
| 15-mL polypropylene centrifuge tube | VWR | 10025-686 | |
| Waterbath | Precision | TSGP05 | |
| Heated stage stereomicroscope | Leica Microsystems | MZ10F | To keep the tissue warm prior to semen collection |
| Brightfield microscope | Leica Microsystems | DMi8 | Optional. For video imaging of the sperm motility |
| Camera | Leica Microsystems | DMC2900 | Optional. For video imaging of the sperm motility |
| Glass slides | Fisher | 12-552-3 | Optional. For video imaging of the sperm motility |
| Coverslip | VWR | 48393-059 | Optional. For video imaging of the sperm motility |
| Bleach | Dilute in dH2O to 10% concentration |
References
- Suarez, S. S., Pacey, A. A. Sperm transport in the female reproductive tract. Hum Reprod Update. 12 (1), 23-37 (2006).
- Bedford, J. M., Yanagimachi, R. Initiation of sperm motility after mating in the rat and hamster. J Androl. 13 (5), 444-449 (1992).
- Lilja, H. Cell biology of semenogelin. Andrologia. 22 Suppl 1, 132-141 (1990).
- Lilja, H., Abrahamsson, P. A., Lundwall, A. Semenogelin, the predominant protein in human semen. Primary structure and identification of closely related proteins in the male accessory sex glands and on the spermatozoa. J Biol Chem. 264 (3), 1894-1900 (1989).
- Veveris-Lowe, T. L., Kruger, S. J., Walsh, T., Gardiner, R. A., Clements, J. A. Seminal fluid characterization for male fertility and prostate cancer: kallikrein-related serine proteases and whole proteome approaches. Semin Thromb Hemost. (33), 87-99 (2007).
- Emami, N., Deperthes, D., Malm, J., Diamandis, E. P. Major role of human KLK14 in seminal clot liquefaction. J Biol Chem. 283 (28), 19561-19569 (2008).
- Gerhard, I., Roth, B., Eggert-Kruse, W., Runnebaum, B. Effects of kallikrein on sperm motility, capillary tube test, and pregnancy rate in an AIH program. Arch Androl. 24 (2), 129-145 (1990).
- Li, S., Garcia, M., Gewiss, R. L., Winuthayanon, W. Crucial role of estrogen for the mammalian female in regulating semen coagulation and liquefaction in vivo. PLoS Genet. 13 (4), e1006743 (2017).
- Elia, J., et al. Human semen hyperviscosity: prevalence, pathogenesis and therapeutic aspects. Asian J Androl. 11 (5), 609-615 (2009).
- Winuthayanon, W., Hewitt, S. C., Orvis, G. D., Behringer, R. R., Korach, K. S. Uterine epithelial estrogen receptor alpha is dispensable for proliferation but essential for complete biological and biochemical responses. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (45), 19272-19277 (2010).
- McLean, A. C., Valenzuela, N., Fai, S., Bennett, S. A. Performing vaginal lavage, crystal violet staining, and vaginal cytological evaluation for mouse estrous cycle staging identification. J Vis Exp. (67), e4389 (2012).
- JoVE Science Education Database. Lab Animal Research. Fundamentals of Breeding and Weaning. JoVE. , (2017).
- Prassas, I., Eissa, A., Poda, G., Diamandis, E. P. Unleashing the therapeutic potential of human kallikrein-related serine proteases. Nat Rev Drug Discov. 14 (3), 183-202 (2015).
- Muytjens, C. M., Vasiliou, S. K., Oikonomopoulou, K., Prassas, I., Diamandis, E. P. Putative functions of tissue kallikrein-related peptidases in vaginal fluid. Nat Rev Urol. 13 (10), 596-607 (2016).
