Raccolta di post-accoppiamento sperma dal tratto riproduttivo femminile e la misurazione della liquefazione dello sperma nei topi
Summary
Liquefazione dello sperma è richiesto per gli spermatozoi di essere liberato dal gel seminale. Questo studio fornisce le procedure per la raccolta dello sperma dal post-coito tratto riproduttivo femminile e misurazione del tempo di liquefazione dello sperma.
Abstract
In topi, sperma eiaculato è depositato nell’utero. Dopo l’eiaculazione, lo sperma cambia consistenza da gel-like a acquoso, un processo chiamato liquefazione. In questo studio, mostriamo come raccogliere il post-eiaculato sperma dal tratto riproduttivo femminile in un modello murino. In primo luogo, adulti topi femminili in fase di estro sono stati alloggiati nella gabbia del maschio durante la notte. La mattina successiva, copulazione è stata confermata dalla presenza di copulatoria spina all’apertura vaginale. I topi femminili con spine copulatore sono stati eutanasizzati e ogni tratto riproduttivo è stato raccolto nel suo complesso (vagina, utero, ovidotti, ovaie), garantendo un sistema chiuso per contenere lo sperma. Il tratto riproduttivo è stato disposto in una microcentrifuga da 1,5 mL, e la vagina è stata tagliata fuori per liberare il suo sperma nel tubo. Per garantire il volume di sperma massimo per l’analisi, senza denti forcipe sono stato utilizzato per spremere i corni uterini da ovarico fine a fine vaginale espellendo lo sperma restante. Il tratto intero riproduttivo è stato poi scartato. Il tubo che contiene lo sperma era filato brevemente verso il basso. Una pipetta capillare 25 μL è stato disposto nel tubo ad un angolo di 180° (parallela alla parete del tubo). La quantità di tempo utilizzato per riempire il tubo capillare alla riga 25 μL è stata registrata. Sperma da un allevatore provato maschio di solito prende circa 60-180 s per riempire un tubo capillare di 25 μL. Questa tecnica di raccolta dello sperma è utilizzabile anche in altre applicazioni a valle quali analisi di imaging e la motilità dello sperma.
Introduction
Il tratto riproduttivo femminile comprende i tratti superiori e inferiori. Il tratto riproduttivo superiore include Tube di Falloppio, l’utero e l’endocervice. Il tratto riproduttivo inferiore comprende l’esocervice e vagina. In esseri umani, lo sperma eiaculato è depositato presso la parete anteriore della vagina, adiacente al ectocervix1. In topi, tuttavia, lo sperma è spazzato in utero pochi minuti dopo l’accoppiamento di2.
Lo sperma contiene gel seminale che si solidifica in pochi secondi di eiaculazione, causando lo sperma per essere intrappolati e immobilizzato3. Liquefazione rilascia lo sperma immobilizzato modificando lo sperma da un simil-gel ad una consistenza acquosa. Questo processo è essenziale per la motilità spermatica e la riproduzione dei mammiferi. Conoscenza della liquefazione dello sperma è principalmente basato su studi in vitro dove lo sperma diventa liquefatto in una piastra di coltura. In esseri umani, l’attività enzimatica di antigene prostatico specifico o PSA (noto anche come callicreina-correlati peptidasi 3 o KLK3) è il maggiore contributo per liquefazione attraverso idrolisi del semenogelins (gelificanti proteine presenti nel liquido seminale)4 ,5,6. Degradazione di semenogelins libera lo sperma dal coagulo seminale, aumento della mobilità degli spermatozoi. Liberate lo sperma nuotare verso le tube di Falloppio per fertilizzare l’uovo. Liquefazione (o viscosità del liquido seminale) test sono uno delle proiezioni standard iniziale per analisi del liquido seminale in cliniche di fertilità per valutare la fertilità maschile7.
Un articolo pubblicato di recente mostra che l’analisi del liquido seminale raccolto da mouse femminile tratto riproduttivo post-corrispondersi può essere utilizzato per illustrare una carenza nella liquefazione che successivamente può causare difetti di fertilità8. Liquefazione difettoso come sperma iperviscosità contribuisce a 11,8-32,3% dei casi infertili in uomini9, suggerendo che normale liquefazione è indispensabile per la riproduzione dei mammiferi. Tuttavia, studi e trattamento dei difetti di liquefazione si sono concentrati esclusivamente sul maschio7. La possibilità che il tratto riproduttivo femminile svolge un ruolo nella liquefazione dello sperma non è stata esplorata. Di conseguenza, i metodi per la raccolta dello sperma e la misurazione del tempo di liquefazione fornire ai ricercatori un nuovo strumento diagnostico per determinare se la liquefazione potrebbe essere una delle cause della sterilità nell’organismo modello di interesse.
Protocol
Representative Results
Discussion
Raccolta di sperma da uteri del mouse possa fornire vantaggi rispetto sperma analisi in vitro come l’ex può illustrare le interazioni fisiologiche tra lo sperma e le secrezioni dal tratto riproduttivo femminile. Le tecniche presentate in questo studio permettono ai ricercatori di determinare la qualità dello sperma nonché la vitalità degli spermatozoi e la motilità in condizioni fisiologiche ideali. Inoltre, ci sono varie analisi a valle che possono essere eseguite utilizzando lo sperma raccolto da…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è sostenuto dal fondo di Start-up di College di medicina veterinaria (WSU) a WW. Gli autori ringraziano Sierra Olsen (WSU) per la lettura critica di questo manoscritto.
Materials
| Toothpick | Diamond | 750-Flat | Autoclaved sterile, use blunted toothpick. Do not use point-ended |
| Dissecting scissors | Fisher | 08-940 | |
| Spring scissors | Roboz | RS-5600 | |
| Fine forceps | Roboz | RS-5045 | |
| 25-μL glass capillary tube | VWR | 53432-761 | |
| Leibovitz’s L-15 media | Life Technologies | 11415064 | Supplement with 1% FBS |
| Fetal bovine serum (FBS) | Gemini Bio-Products | 100-106 | |
| 1.5-mL microcentrifuge tube | Axygen | MCT-150-C | |
| 2-mL microcentrifuge tube | Axygen | MCT-200-A | |
| Digital dry block heater | VWR | 13259-052 | For warming the microcentrifuge tube prior to semen collection |
| Minicentrifuge | Corning | LSE 6765 | |
| 35-mm culture dish | VWR | 10861-656 | |
| 15-mL polypropylene centrifuge tube | VWR | 10025-686 | |
| Waterbath | Precision | TSGP05 | |
| Heated stage stereomicroscope | Leica Microsystems | MZ10F | To keep the tissue warm prior to semen collection |
| Brightfield microscope | Leica Microsystems | DMi8 | Optional. For video imaging of the sperm motility |
| Camera | Leica Microsystems | DMC2900 | Optional. For video imaging of the sperm motility |
| Glass slides | Fisher | 12-552-3 | Optional. For video imaging of the sperm motility |
| Coverslip | VWR | 48393-059 | Optional. For video imaging of the sperm motility |
| Bleach | Dilute in dH2O to 10% concentration |
References
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