Samling efter parning sperma från de kvinnliga fortplantningsorganen och mätning av sperma kondensering i möss
Summary
Sperman kondensering krävs för spermierna att bli befriade från seminal gelen. Denna studie ger förfarandena för insamling av sperma från de kvinnliga fortplantningsorganen efter samlag, och sperma kondensering mättid.
Abstract
Hos möss deponeras ejakulerad sperma i livmodern. Efter utlösning, sperman ändrar konsistens från gel-liknande till vattnig, en process som kallas liquefaction. I denna studie visar vi hur man samlar in efter ejakulerad sperma från kvinnliga fortplantningsorganen i en musmodell. Första, vuxen honmöss i brunst scenen var inrymt i en manlig buren över natten. Nästa morgon, bekräftades parning av närvaron av copulatory plug på slidöppningen. Honmöss med copulatory pluggar var euthanized, och varje fortplantningsorganen samlades som helhet (slidan, livmodern, oviducts, äggstockarna), säkerställa ett slutet system innehåller sperman. Fortplantningsorganen placerades i ett 1,5 mL mikrocentrifug rör, och slidan var avskuren för att släppa sperman i röret. För att säkerställa maximal sperma volym för analys, användes tandlös pincett klämma uterin hornen från äggstockarna slutet till vaginal slutet utvisa kvarvarande sperma. Hela fortplantningsorganen var sedan kasseras. Sperma-innehållande röret knoppades kort ner. 25 μL kapillär pipett placerades in i röret i 180° vinkel (parallell till rörväggen). Mängden tid som används för att fylla kapillärröret till raden 25 μL spelades. Sperma från en bevisad manliga uppfödare tar normalt ca 60-180 s att fylla ett 25 μL kapillärrör. Denna sperma samling teknik kan också användas i andra nedströms tillämpningar såsom spermier imaging och motilitet analys.
Introduction
De kvinnliga fortplantningsorganen består av de övre och nedre skrifter. Övre fortplantningsorganen inkluderar äggledarna, livmodern och livmoderhalskanalens. Lägre fortplantningsorganen ingår i ectocervix och slidan. I människor sätts ejakulerad sperma på den främre väggen av vagina, angränsande till ectocervix1. I möss, men sveps sperman in i livmodern inom minuter efter parning2.
Sperma innehåller banbrytande gel som är stelnat inom sekunder efter utlösning, orsakar spermierna att bli anhållna och orörlig3. Kondensering släpper immobiliserade spermier genom att ändra sperma från en gel-liknande en vattnig konsistens. Denna process är nödvändigt för spermiernas rörlighet och däggdjur reproduktion. Kunskap om sperma kondensering är mestadels baserade på in vitro- studier där sperma blir flytande i en kultur maträtt. I människor är den enzymatiska aktiviteten av prostataspecifikt antigen eller PSA (kallas även kallikrein-relaterade-hämmare 3 eller KLK3) den största bidragsgivaren för kondensering genom hydrolys av semenogelins (gelbildande proteiner finns i sperma)4 ,5,6. Nedbrytning av semenogelins frigör spermier från seminal koaglet, öka spermier rörlighet. Frigörs spermier simma mot äggledaren att befrukta ägget. Kondensering (eller sperma viskositet) tester är en av standard första visningarna för spermaanalys i fertilitetskliniker att bedöma manlig fertilitet7.
En nyligen publicerad artikel visar att analys av sädesvätskan samlas in från den kvinnliga mus fortplantningsorganen efter parning kan användas för att illustrera en brist i kondensering som därefter kan orsaka fertilitet defekter8. Defekt kondensering såsom sperma hyperviskositet bidrar till 11,8-32,3% av infertila män9, tyder på att normal kondensering är oumbärlig för däggdjur reproduktion. Dock har studier och behandling av kondensering defekter fokuserat på den manliga7. Möjligheten att de kvinnliga fortplantningsorganen spelar en roll i sperma kondensering har inte undersökts. Därför är metoder för seminstation och kondensering mättid ger forskare en roman diagnostiskt verktyg för att avgöra huruvida kondensering kan vara en av orsakerna till infertilitet i modell organismen av intresse.
Protocol
Representative Results
Discussion
Insamling av sperma från mus livmödrar kan ge fördelar över sperma analys i vitro som den förstnämnda kan illustrera de fysiologiska interaktioner mellan sperman och sekret från kvinnliga fortplantningsorganen. De tekniker som presenteras i denna studie kan forskare avgöra sperma kvalitet samt spermier livskraft och motilitet i idealisk fysiologiska förhållanden. Dessutom finns det olika nedströms analyser som kan utföras med den sperma som samlats från livmödrarna, exempelvis spermier kan…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta arbete stöds av College av Veterinary Medicin (WSU) startfonden till WW. Författarna vill tacka Sierra Olsen (WSU) för kritisk läsning av detta manuskript.
Materials
| Toothpick | Diamond | 750-Flat | Autoclaved sterile, use blunted toothpick. Do not use point-ended |
| Dissecting scissors | Fisher | 08-940 | |
| Spring scissors | Roboz | RS-5600 | |
| Fine forceps | Roboz | RS-5045 | |
| 25-μL glass capillary tube | VWR | 53432-761 | |
| Leibovitz’s L-15 media | Life Technologies | 11415064 | Supplement with 1% FBS |
| Fetal bovine serum (FBS) | Gemini Bio-Products | 100-106 | |
| 1.5-mL microcentrifuge tube | Axygen | MCT-150-C | |
| 2-mL microcentrifuge tube | Axygen | MCT-200-A | |
| Digital dry block heater | VWR | 13259-052 | For warming the microcentrifuge tube prior to semen collection |
| Minicentrifuge | Corning | LSE 6765 | |
| 35-mm culture dish | VWR | 10861-656 | |
| 15-mL polypropylene centrifuge tube | VWR | 10025-686 | |
| Waterbath | Precision | TSGP05 | |
| Heated stage stereomicroscope | Leica Microsystems | MZ10F | To keep the tissue warm prior to semen collection |
| Brightfield microscope | Leica Microsystems | DMi8 | Optional. For video imaging of the sperm motility |
| Camera | Leica Microsystems | DMC2900 | Optional. For video imaging of the sperm motility |
| Glass slides | Fisher | 12-552-3 | Optional. For video imaging of the sperm motility |
| Coverslip | VWR | 48393-059 | Optional. For video imaging of the sperm motility |
| Bleach | Dilute in dH2O to 10% concentration |
References
- Suarez, S. S., Pacey, A. A. Sperm transport in the female reproductive tract. Hum Reprod Update. 12 (1), 23-37 (2006).
- Bedford, J. M., Yanagimachi, R. Initiation of sperm motility after mating in the rat and hamster. J Androl. 13 (5), 444-449 (1992).
- Lilja, H. Cell biology of semenogelin. Andrologia. 22 Suppl 1, 132-141 (1990).
- Lilja, H., Abrahamsson, P. A., Lundwall, A. Semenogelin, the predominant protein in human semen. Primary structure and identification of closely related proteins in the male accessory sex glands and on the spermatozoa. J Biol Chem. 264 (3), 1894-1900 (1989).
- Veveris-Lowe, T. L., Kruger, S. J., Walsh, T., Gardiner, R. A., Clements, J. A. Seminal fluid characterization for male fertility and prostate cancer: kallikrein-related serine proteases and whole proteome approaches. Semin Thromb Hemost. (33), 87-99 (2007).
- Emami, N., Deperthes, D., Malm, J., Diamandis, E. P. Major role of human KLK14 in seminal clot liquefaction. J Biol Chem. 283 (28), 19561-19569 (2008).
- Gerhard, I., Roth, B., Eggert-Kruse, W., Runnebaum, B. Effects of kallikrein on sperm motility, capillary tube test, and pregnancy rate in an AIH program. Arch Androl. 24 (2), 129-145 (1990).
- Li, S., Garcia, M., Gewiss, R. L., Winuthayanon, W. Crucial role of estrogen for the mammalian female in regulating semen coagulation and liquefaction in vivo. PLoS Genet. 13 (4), e1006743 (2017).
- Elia, J., et al. Human semen hyperviscosity: prevalence, pathogenesis and therapeutic aspects. Asian J Androl. 11 (5), 609-615 (2009).
- Winuthayanon, W., Hewitt, S. C., Orvis, G. D., Behringer, R. R., Korach, K. S. Uterine epithelial estrogen receptor alpha is dispensable for proliferation but essential for complete biological and biochemical responses. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (45), 19272-19277 (2010).
- McLean, A. C., Valenzuela, N., Fai, S., Bennett, S. A. Performing vaginal lavage, crystal violet staining, and vaginal cytological evaluation for mouse estrous cycle staging identification. J Vis Exp. (67), e4389 (2012).
- JoVE Science Education Database. Lab Animal Research. Fundamentals of Breeding and Weaning. JoVE. , (2017).
- Prassas, I., Eissa, A., Poda, G., Diamandis, E. P. Unleashing the therapeutic potential of human kallikrein-related serine proteases. Nat Rev Drug Discov. 14 (3), 183-202 (2015).
- Muytjens, C. M., Vasiliou, S. K., Oikonomopoulou, K., Prassas, I., Diamandis, E. P. Putative functions of tissue kallikrein-related peptidases in vaginal fluid. Nat Rev Urol. 13 (10), 596-607 (2016).
