Opdigte optisk kvalitet glasoverflader for at studere makrofag Fusion
Summary
Denne protokol beskriver fabrikation af optiske kvalitet glasoverflader adsorberet med forbindelser, der indeholder langkædede carbonhydrider, som kan bruges til at overvåge makrofag fusion af levende enheder og muliggør super-resolution mikroskopi af faste enheder .
Abstract
Visualisere dannelsen af multinucleated kæmpe celler (MGCs) fra levende enheder har udfordrende skyldes, at mest levende billedbehandling teknikker kræver formering af lys gennem glas, men på glas makrofag fusion er en sjælden begivenhed. Denne protokol præsenterer fabrikation af flere optiske kvalitet glasoverflader hvor adsorption af forbindelser, der indeholder langkædede carbonhydrider forvandler glas til en fusogenic overflade. Først, forberedelse af rene glasoverflader som udgangspunkt materiale til overflade ændring er beskrevet. For det andet, en metode er fastsat for adsorption af forbindelser, der indeholder langkædede carbonhydrider for at konvertere ikke-fusogenic glas til fusogenic substrat. For det tredje, denne protokol beskriver fabrikation af overflade micropatterns, der fremmer en høj grad af spatiotemporelle kontrol over MGC dannelse. Endelig, opdigte glas bund retter er beskrevet. Eksempler på brug af in vitro- celle systemet som model til at studere makrofag fusion og MGC dannelse er vist.
Introduction
Dannelsen af MGCs følger en række patologiske stater i det menneskelige legeme adskilles på kronisk betændelse1. Trods aftale det mononukleære makrofager smelter sammen og form MGCs2, overraskende få studier har vist fusion i forbindelse med levende enheder3,4. Dette skyldes, at rengøre glasoverflader, der er nødvendige for de fleste Billeddannende teknikker ikke fremmer makrofag fusion når induceret af inflammatoriske cytokiner5. Faktisk, hvis rene glas bruges som substrat for makrofag fusion, så lavt at mellemliggende forstørrelse mål (dvs., 10-20 X) og mere end 15 h af kontinuerlig imaging ofte er forpligtet til at overholde en enkelt fusion begivenhed.
På den anden hånd, fusogenic plastoverflader (fx, permanox) eller bakteriologiske kvalitet plast fremme fusion2. Imaging gennem plast er imidlertid problematisk, fordi underlaget er tyk og scatters lys. Dette komplicerer imaging da længe arbejde afstand (LWD) mål er nødvendige. LWD målsætninger har dog som regel lavt lys indsamling kapacitet i forhold til deres coverslip-korrigeret modstykke. Yderligere, teknikker, der udnytter ændringer i polariteten af lys, der passerer gennem modellen som differential interferens kontrast er umuligt, da plast er birefringent. Barrierer forbundet med brugen af plast er yderligere understreget ved, at det er umuligt at forudsige, hvor makrofag fusion/MGC dannelsen sker på overfladen. Sammen, disse begrænsninger begrænser visualisering af makrofag fusion til fase kontrast optik, udvidet samlede imaging varigheder (> 15 kontinuerlig timer), og lav opløsning.
Vi har for nylig identificeret en meget fusogenic barometer overflade mens enkelt-molekyle super opløsning mikroskopi med faste makrofager/MGCs4. Denne observation blev overraskende fordi rent glas overflader fremme fusion med en meget lav sats på ~ 5% efter 24 h i overværelse af interleukin-4 (IL-4), som bestemmes af fusionen indeks4. Vi fandt, at kapaciteten til at fremme fusion var på grund af oleamide forurening. Adsorptionen af oleamide eller andre forbindelser, der ligeledes indeholdt langkædede carbonhydrider fremstillet glas fusogenic. De fleste fusogenic sammensatte (paraffin voks) var micropatterned, og det bibringes en høj grad af spatiotemporelle kontrol over makrofag fusion og en 2-fold stigning i antallet af fusion begivenheder observeret inden for det samme beløb af tid i forhold til permanox. Disse optiske kvalitet overflader gav den første glimt til morfologiske karaktertræk og kinetik, der styrer dannelsen af MGCs i levende enheder.
I denne protokol beskriver vi fabrikation af en række glasoverflader, der kan bruges til at overvåge dannelsen af MGCs fra levende enheder. Derudover viser vi, at disse overflader er indstillet til langt-ager super-resolution teknikker. Overflade fabrikation er afhængig af målet med forsøget, og hver overflade er beskrevet med tilhørende eksempler i proceduren tekst.
Protocol
Representative Results
Discussion
Behovet for at identificere og efterfølgende udvikle optisk kvalitet glasoverflader, der fremmer makrofag fusion skyldtes, at indtil for nylig ikke offentliggjort undersøgelse direkte visualiseret makrofag fusion inden for rammerne af levende enheder3, 4. Dette er skyldes, at fusogenic plast overflader, der er almindeligt anvendt kræver LWD mål og er stort set begrænset til fase kontrast optik. Disse hindringer er blevet overvundet gennem engineering en opt…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi vil gerne takke medlemmerne af Ugarova laboratorium og efterforskere i centrum for Metabolic og vaskulære biologi for nyttig diskussion af dette arbejde. James Faust ønsker at udtrykke sin taknemmelighed over for instruktører på det europæiske molekylærbiologiske laboratorium Super opløsning mikroskopi kursus i 2015. Vi vil gerne takke Satya Khuon på Janelia for at få hjælp med prøveforberedelse til LLSM. Under gennemgang og filme dele af dette arbejde var James Faust understøttes af en T32 Fellowship (5T32DK007569-28). Komponenten gitter lys ark af dette arbejde blev støttet af HHMI og Betty og Gordon Moore Foundation. T.U. er finansieret af NIH give HL63199.
Materials
| Plasma cleaner | Harrick Plasma | PCD-32G | |
| Finder grid | Electron microscopy sciences | G400F1-Au | any gold TEM grid will work |
| Cover glass (22×22 mm) | Thor Labs | CG15CH | use only high stringency cover glass |
| Paraffin wax | Sigma Aldrich | 17310 | |
| Petrolatum | Sigma Aldrich | 16415 | must be α-tocopherol-free if substituted |
| Oleamide | Sigma Aldrich | O2136 | prepare fresh |
| Isopropanol | Sigma Aldrich | 278475 | |
| Toluene | Sigma Aldrich | 244511 | |
| Acetone | VWR International | BDH1101 | |
| Ethanol | Electron microscopy sciences | 15050 | use low dissolved solids ethanol |
| Hydrochloric acid | Fischer Scientific | A144C-212 | use to acid wash cover glass |
| Slyguard 184 | VWR International | 102092-312 | mix in a 1:10 ratio and cure at 50 °C for 4 h |
| 35 mm petri dish | Santa Cruz Biotech | sc-351864 | |
| Dumont no. 5 forceps | Electron microscopy sciences | 72705 | ideal for removing TEM grid in section 3.5 |
| FBS | Atlanta Biological | S11550 | |
| DMEM:F12 | Corning | 10-092 | contains 15 mM HEPES |
| Pen/Strept | Corning | 30-002-Cl | |
| HBSS | Corning | 21-023 | |
| BSA solution | Sigma Aldrich | A9576 | use at 0.1% in HBSS to wash non-adherent macrophages |
| IL-4 | Genscript | Z02996 | aliquot at 10 μg/mL and store at -20 °C |
| C57BL/6J | Jackson Laboratory | 000664 | use for fixed samples or techniques that do not require contrast agents |
| eGFP-LifeAct mice | n/a | n/a | use for live fluorescence imaging |
| Kimwipe | Kimberly Clark | 34155 | use to polish hydrocarbon adsorbed surfaces |
References
- McNally, A. K., Anderson, J. M. Interleukin-4 induces foreign body giant cells from human monocytes/macrophages. Differential lymphokine regulation of macrophage fusion leads to morphological variants of multinucleated giant cells. Am J Pathol. 147 (5), 1487 (1995).
- Helming, L., Gordon, S. Molecular mediators of macrophage fusion. Trends Cell Biol. 19 (10), 514-522 (2009).
- Podolnikova, N. P., Kushchayeva, Y. S., Wu, Y., Faust, J., Ugarova, T. P. The Role of Integrins α M β 2 (Mac-1, CD11b/CD18) and α D β 2 (CD11d/CD18) in Macrophage Fusion. Am J Pathol. 186 (8), 2105-2116 (2016).
- Faust, J. J., Christenson, W., Doudrick, K., Ros, R., Ugarova, T. P. Development of fusogenic glass surfaces that impart spatiotemporal control over macrophage fusion: Direct visualization of multinucleated giant cell formation. Biomaterials. 128, 160-171 (2017).
- Jenney, C. R., Anderson, J. M. Alkylsilane-modified surfaces: Inhibition of human macrophage adhesion and foreign body giant cell formation. J Biomed Mater Res. 46 (1), 11-21 (1999).
- Vignery, A. Methods to fuse macrophages in vitro. Cell Fusion: Overviews Methods. , 383-395 (2008).
- Zhao, Q., et al. Foreign-body giant cells and polyurethane biostability: In vivo correlation of cell adhesion and surface cracking. J Biomed Mater Res. 25 (2), 177-183 (1991).
- Anderson, J. M., Rodriguez, A., Chang, D. T. Foreign body reaction to biomaterials. Semin Immunol. 20 (2), 86-100 (2008).
- Jenney, C. R., Anderson, J. M. Effects of surface-coupled polyethylene oxide on human macrophage adhesion and foreign body giant cell formation in vitro. J Biomed Mater Res. 44 (2), 206-216 (1999).
- DeFife, K. M., Colton, E., Nakayama, Y., Matsuda, T., Anderson, J. M. Spatial regulation and surface chemistry control of monocyte/macrophage adhesion and foreign body giant cell formation by photochemically micropatterned surfaces. J Biomed Mater Res. 45 (2), 148-154 (1999).
- Jenney, C. R., DeFife, K. M., Colton, E., Anderson, J. M. Human monocyte/macrophage adhesion, macrophage motility, and IL-4-induced foreign body giant cell formation on silane-modified surfaces in vitro. J Biomed Mater Res. 41 (2), 171-184 (1998).
- Hell, S. W., Wichmann, J. Breaking the diffraction resolution limit by stimulated emission: stimulated-emission-depletion fluorescence microscopy. Opt Lett. 19 (11), 780-782 (1994).
- van de Linde, S., et al. Direct stochastic optical reconstruction microscopy with standard fluorescent probes. Nat Protocols. 6 (7), 991-1009 (2011).
- Fölling, J., et al. Fluorescence nanoscopy by ground-state depletion and single-molecule return. Nat Methods. 5 (11), 943-945 (2008).
- Heilemann, M., et al. Subdiffraction-resolution fluorescence imaging with conventional fluorescent probes. Ange Chem Int Edit. 47 (33), 6172-6176 (2008).
- Betzig, E. Proposed method for molecular optical imaging. Optics Letters. 20 (3), 237-239 (1995).
- Betzig, E., et al. Imaging intracellular fluorescent proteins at nanometer resolution. Science. 313 (5793), 1642-1645 (2006).
- Shtengel, G., et al. Interferometric fluorescent super-resolution microscopy resolves 3D cellular ultrastructure. P Natl Acad Sci U S A. 106 (9), 3125-3130 (2009).
- Shtengel, G., et al. Imaging cellular ultrastructure by PALM, iPALM, and correlative iPALM-EM. Method Cell Biol. 123, 273-294 (2013).
- Chen, B. C., et al. Lattice light-sheet microscopy: Imaging molecules to embryos at high spatiotemporal resolution. Science. 346 (6208), 1257998 (2014).
- Planchon, T. A., et al. Rapid three-dimensional isotropic imaging of living cells using Bessel beam plane illumination. Nat Methods. 8 (5), 417-423 (2011).
