Fabricação de superfícies de vidro de qualidade óptica para estudar a fusão do macrófago
Summary
Este protocolo descreve a fabricação de superfícies de vidro ótico-qualidade adsorvido com compostos contendo hidrocarbonetos de cadeia longa que podem ser usados para monitorar fusão macrófago de espécimes vivos e permite a microscopia de super-resolução de espécimes fixos .
Abstract
Visualizando a formação de células gigantes multinucleadas (MGCs) de espécimes vivos tem sido um desafio devido ao fato de que mais técnicas de imagem ao vivo requerem a propagação da luz através do vidro, mas no vidro fusão macrófago é um evento raro. Este protocolo apresenta a preparação de várias superfícies de vidro de qualidade óptica onde a adsorção de compostos contendo hidrocarbonetos de cadeia longa transforma o vidro em uma superfície de fusogenic. Em primeiro lugar, a preparação de superfícies de vidro limpo como material para a modificação da superfície de partida é descrita. Em segundo lugar, um método é fornecido para a adsorção de compostos contendo hidrocarbonetos de cadeia longa para converter não-fusogenic vidro em um substrato de fusogenic. Em terceiro lugar, este protocolo descreve a fabricação de superfície micropatterns que promovem um elevado grau de controle spatiotemporal sobre formação de MGC. Finalmente, fabricar pratos de vidro inferior é descrito. Exemplos de utilização deste sistema de célula em vitro como um modelo para estudar a fusão do macrófago e MGC formação são mostrados.
Introduction
A formação de MGCs acompanha uma série de estados patológicos, no corpo humano distinto de inflamação crônica1. Apesar do acordo que mononucleadas macrófagos fundem-se para formar MGCs2, surpreendentemente poucos estudos têm mostrado a fusão em contexto com vivos espécimes3,4. Isso ocorre porque as superfícies de vidro limpo que são necessárias para a maioria das técnicas de imagem não promover fusão macrófago quando induzida por citocinas inflamatórias5. Com efeito, se limpa vidro é usado como substrato para a fusão do macrófago, então baixa a objectivos intermédios ampliação (ou seja, 10-20 X) e mais de 15 h de contínua imagens são geralmente necessário para observar um evento único de fusão.
Na outra mão, fusogenic superfícies plásticas (por exemplo, permanox) ou plástico grade bacteriológica promova fusão2. No entanto, imagens através do plástico é problemática, porque o substrato é espesso e dispersa a luz. Isso complica a imagem latente, pois há muito trabalho objectivos de distância (LWD) são necessários. No entanto, objectivos LWD geralmente têm baixa capacidade em comparação com suas contrapartes da lamela-corrigido de captura de luz. Além disso, técnicas que exploram as mudanças na polaridade da luz que passa através da amostra como contraste de interferência diferencial são impossíveis, já que o plástico é birrefringentes. As barreiras associadas ao uso do plástico são ressaltou ainda mais pelo fato de que é impossível prever onde a formação de fusão/MGC macrófago ocorrerá na superfície. Juntos, essas limitações restringem a visualização da fusão do macrófago a óptica de contraste de fase, estendido durações de imagem totais (> 15 horas contínuas) e baixa resolução.
Recentemente, nós identificamos uma superfície de vidro altamente fusogenic durante a realização de microscopia de resolução super single-molécula com macrófagos fixos/MGCs4. Esta observação foi surpreendente porque limpa vidro superfícies promovem fusão à baixíssima taxa de ~ 5% após 24 h na presença de interleucina-4 (IL-4), conforme determinado pela fusão do índice4. Descobrimos que a capacidade de promover fusão era devido à contaminação de oleamide. Adsorção de oleamide ou outros compostos que da mesma forma continham hidrocarbonetos de cadeia longa feita a fusogenic de vidro. A maioria dos compostos fusogenic (parafina) foi micropatterned, e é transmitido a um alto grau de controle spatiotemporal sobre fusão de macrófagos e um aumento de 2 vezes no número de eventos de fusão observado dentro a mesma quantidade de tempo em comparação com permanox. Estas superfícies ópticas-qualidade desde o primeiro vislumbre nas características morfológicas e cinética que regem a formação de MGCs em espécimes vivos.
Neste protocolo, descrevemos a fabricação de uma variedade de superfícies de vidro que pode ser usado para monitorar a formação de MGCs de espécimes vivos. Além disso, mostramos que essas superfícies são receptivos às técnicas de super-resolução consideravelmente-campo. Fabricação de superfície é dependente sobre o objetivo do experimento, e cada superfície é descrito com exemplos relacionados no texto processo.
Protocol
Representative Results
Discussion
A necessidade de identificar e desenvolver posteriormente as superfícies de vidro ótico-qualidade que promovem a fusão do macrófago resultou do fato de que até recentemente não publicado estudo diretamente visualizado fusão macrófago no contexto de vida espécimes3, 4. Isto é devido ao fato de que fusogenic as superfícies plásticas que são comumente usadas exigem objectivos LWD e são em grande parte limitadas a óptica de contraste de fase. Estas ba…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Gostaríamos de agradecer os membros do laboratório de Ugarova e investigadores no centro para Biologia Vascular e metabólica para discussão útil deste trabalho. James Faust deseja expressar sua gratidão aos instrutores no curso de laboratório de Biologia Molecular Europeu Super resolução microscopia em 2015. Desejamos agradecer Satya Khuon no Janelia ajuda com preparação da amostra para LLSM. Durante a revisão e a filmagens porções deste trabalho James Faust foi apoiado por uma bolsa T32 (5T32DK007569-28). O componente de folha de luz da estrutura deste trabalho foi apoiado pelo HHMI e Betty e Gordon Moore Foundation. T.U. é financiado pelo NIH conceder HL63199.
Materials
| Plasma cleaner | Harrick Plasma | PCD-32G | |
| Finder grid | Electron microscopy sciences | G400F1-Au | any gold TEM grid will work |
| Cover glass (22×22 mm) | Thor Labs | CG15CH | use only high stringency cover glass |
| Paraffin wax | Sigma Aldrich | 17310 | |
| Petrolatum | Sigma Aldrich | 16415 | must be α-tocopherol-free if substituted |
| Oleamide | Sigma Aldrich | O2136 | prepare fresh |
| Isopropanol | Sigma Aldrich | 278475 | |
| Toluene | Sigma Aldrich | 244511 | |
| Acetone | VWR International | BDH1101 | |
| Ethanol | Electron microscopy sciences | 15050 | use low dissolved solids ethanol |
| Hydrochloric acid | Fischer Scientific | A144C-212 | use to acid wash cover glass |
| Slyguard 184 | VWR International | 102092-312 | mix in a 1:10 ratio and cure at 50 °C for 4 h |
| 35 mm petri dish | Santa Cruz Biotech | sc-351864 | |
| Dumont no. 5 forceps | Electron microscopy sciences | 72705 | ideal for removing TEM grid in section 3.5 |
| FBS | Atlanta Biological | S11550 | |
| DMEM:F12 | Corning | 10-092 | contains 15 mM HEPES |
| Pen/Strept | Corning | 30-002-Cl | |
| HBSS | Corning | 21-023 | |
| BSA solution | Sigma Aldrich | A9576 | use at 0.1% in HBSS to wash non-adherent macrophages |
| IL-4 | Genscript | Z02996 | aliquot at 10 μg/mL and store at -20 °C |
| C57BL/6J | Jackson Laboratory | 000664 | use for fixed samples or techniques that do not require contrast agents |
| eGFP-LifeAct mice | n/a | n/a | use for live fluorescence imaging |
| Kimwipe | Kimberly Clark | 34155 | use to polish hydrocarbon adsorbed surfaces |
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