Makrofaj Fusion çalışmaya imalatı kaliteli optik cam yüzeyler
Summary
Bu iletişim kuralı, makrofaj füzyon yaşam örneklerin izlemek için kullanılan ve süper çözünürlük mikroskobu sabit örneklerin sağlayan uzun zincirli hidrokarbon içeren bileşikler ile adsorbe kaliteli optik cam yüzeyler imalatı açıklar .
Abstract
Multinucleated dev hücreler (MGCs) oluşumunu yaşam örnekler görüntülenmesi en canlı görüntüleme teknikleri cam aracılığıyla ışık yayılmasını gerektirir, ancak camına makrofaj füzyon nadir bir olaydır nedeniyle aslında bu zor oldu. Bu iletişim kuralı birkaç kaliteli optik cam yüzeyler imalatı nerede adsorpsiyon uzun zincirli hidrokarbon içeren bileşiklerin fusogenic yüzey içine cam dönüşümleri sunar. İlk olarak, hazırlık temiz cam yüzeylerin yüzey modifikasyonu için malzeme başlangıç olarak tanımlanır. İkincisi, bir yöntem adsorpsiyon sigara fusogenic cam fusogenic substrat dönüştürmek için uzun zincirli hidrokarbon içeren bileşikler için sağlanmıştır. Üçüncü olarak, bu iletişim kuralını MGC oluşumu üzerinde kronolojik zamanmekansal kontrol yüksek derecede teşvik yüzey micropatterns imalatı açıklar. Son olarak, cam alt yemekleri imalatı açıklanmıştır. Makrofaj füzyon ve MGC oluşumu için bir model olarak bu vitro hücre sisteminin kullanım örnekleri gösterilir.
Introduction
MGCs oluşumu kronik inflamasyon1tarafından seçkin insan vücudunda patolojik devletlerin bir dizi eşlik eder. İltihap makrofajlar forma MGCs2sigorta sözleşmesi rağmen şaşırtıcı birkaç çalışmalar yaşam ile bağlamda füzyon göstermiştir örnekler3,4. Bunun nedeni çoğu görüntüleme teknikleri için gerekli olan temiz cam yüzeyler inflamatuar sitokinlerin5tarafından indüklenen zaman makrofaj füzyon teşvik yok. Gerçekten de, temiz cam bir substrat makrofaj füzyon için sonra düşük orta büyütme hedefleri (Yani, 10-20 X) ve daha 15 h sürekli kullanılırsa görüntüleme kez bir tek füzyon olayı gözlemlemek için gereklidir.
Diğer el, fusogenic plastik yüzey (örneğin, permanox) veya bakteriyolojik sınıf plastik fusion2teşvik. Ancak, çünkü belgili tanımlık substrate kalın ve ışık scatters görüntüleme plastik aracılığıyla problemlidir. Bu kadar çalışma mesafesi (LWD) hedefleri gerekli olduğundan Imaging karıştırıyor. Ancak, LWD hedefler genellikle düşük ışık coverslip-düzeltilmiş karşılık gelen göre kapasite toplama var. Ayrıca, plastik birefringent bu yana değişiklikleri fark girişim kontrast gibi numune geçen ışık polarizasyonu yararlanma teknikleri imkansız. Engelleri plastik kullanımı ile ilgili daha fazla makrofaj füzyon/MGC formasyonu yüzeyde gerçekleşeceği tahmin etmek mümkün değildir aslında tarafından vurguladı. Birlikte, bu sınırlamalar faz kontrast optik, toplam görüntüleme süreleri genişletilmiş makrofaj fusion görselleştirme kısıtlamak (> 15 sürekli saat) ve düşük çözünürlüklü.
Son zamanlarda bir çok fusogenic cam yüzey tek molekül süper çözünürlük mikroskobu ile sabit makrofajlar/MGCs4yürütürken tespit. Bu gözlem yapıldı çünkü şaşırtıcı temiz cam yüzeyler füzyon de çok düşük oranda teşvik ~ %5 İnterlökin-4 (Il-4) füzyon tarafından belirlenen huzurunda 24 saat sonra dizin4. Füzyon tanıtmak için kapasite oleamide kirlilik nedeniyle olduğunu ortaya koymuştur. Adsorpsiyon oleamide veya benzer şekilde uzun zincirli hidrokarbon bulunan diğer bileşikler cam fusogenic yaptı. Çoğu fusogenic bileşik (parafin balmumu) micropatterned yapıldı ve makrofaj fusion ve permanox için karşılaştırıldığında zaman aynı miktarda içinde gözlenen füzyon olayların sayısını logosuna 2 kat artış kronolojik zamanmekansal kontrol yüksek düzeyde öğretilir. Bu optik kalitesi yüzeyler ilk bakışta Morfolojik özellikleri ve yaşam numuneler MGCs oluşumunda yöneten Kinetik tarafından sağlanan.
Bu protokol için MGCs oluşumu yaşam örnekler üzerinden izlemek için kullanılan cam yüzeyler çeşitli imalatı açıklar. Buna ek olarak, biz bu yüzeyler uzakta-tarla süper çözümleme teknikleri için mükellef olduğunu göstermektedir. Yüzey imalat denemenin amacı bağlıdır ve her yüzeyi ile ilgili örnekler devam etmeden metinde anlatılan.
Protocol
Representative Results
Discussion
Belirlemek ve daha sonra makrofaj füzyon teşvik kaliteli optik cam yüzeyler geliştirmek gerek kaynaklandığını son Hayır yayınlanan çalışma doğrudan kadar yaşam içinde belgili tanımlık bağlam makrofaj füzyon görselleştirildiği aslında örnekler3, 4. Yaygın olarak kullanılan fusogenic plastik yüzeyler LWD hedefleri gerektirir ve faz kontrast optik için büyük ölçüde sınırlı nedeniyle gerçeğini bu. Bu engellerin sadece makrofaj …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ugarova laboratuvar ve Müfettişler Merkezi üyeleri metabolik ve vasküler Biyoloji için bu eser ilgili yararlı bilgiler için teşekkür etmek istiyorum. James Faust 2015 yılında Avrupa Moleküler Biyoloji Laboratuvarı süper çözünürlük mikroskobu sahasında eğitmenler için minnettarlığını ifade istiyor. Satya Khuon LLSM için numune hazırlama konusunda yardım için Janelia teşekkür etmek istiyorum. Bir daha gözden geçirme ve bu eserin filme bölümleri sırasında James Faust T32 Bursu (5T32DK007569-28) tarafından desteklenmiştir. Bu eser kafes ışık sayfası bileşeni HHMI ve Betty ve Gordon Moore Vakfı tarafından desteklenmiştir. T.U. NIH tarafından finanse edilen HL63199 verin.
Materials
| Plasma cleaner | Harrick Plasma | PCD-32G | |
| Finder grid | Electron microscopy sciences | G400F1-Au | any gold TEM grid will work |
| Cover glass (22×22 mm) | Thor Labs | CG15CH | use only high stringency cover glass |
| Paraffin wax | Sigma Aldrich | 17310 | |
| Petrolatum | Sigma Aldrich | 16415 | must be α-tocopherol-free if substituted |
| Oleamide | Sigma Aldrich | O2136 | prepare fresh |
| Isopropanol | Sigma Aldrich | 278475 | |
| Toluene | Sigma Aldrich | 244511 | |
| Acetone | VWR International | BDH1101 | |
| Ethanol | Electron microscopy sciences | 15050 | use low dissolved solids ethanol |
| Hydrochloric acid | Fischer Scientific | A144C-212 | use to acid wash cover glass |
| Slyguard 184 | VWR International | 102092-312 | mix in a 1:10 ratio and cure at 50 °C for 4 h |
| 35 mm petri dish | Santa Cruz Biotech | sc-351864 | |
| Dumont no. 5 forceps | Electron microscopy sciences | 72705 | ideal for removing TEM grid in section 3.5 |
| FBS | Atlanta Biological | S11550 | |
| DMEM:F12 | Corning | 10-092 | contains 15 mM HEPES |
| Pen/Strept | Corning | 30-002-Cl | |
| HBSS | Corning | 21-023 | |
| BSA solution | Sigma Aldrich | A9576 | use at 0.1% in HBSS to wash non-adherent macrophages |
| IL-4 | Genscript | Z02996 | aliquot at 10 μg/mL and store at -20 °C |
| C57BL/6J | Jackson Laboratory | 000664 | use for fixed samples or techniques that do not require contrast agents |
| eGFP-LifeAct mice | n/a | n/a | use for live fluorescence imaging |
| Kimwipe | Kimberly Clark | 34155 | use to polish hydrocarbon adsorbed surfaces |
References
- McNally, A. K., Anderson, J. M. Interleukin-4 induces foreign body giant cells from human monocytes/macrophages. Differential lymphokine regulation of macrophage fusion leads to morphological variants of multinucleated giant cells. Am J Pathol. 147 (5), 1487 (1995).
- Helming, L., Gordon, S. Molecular mediators of macrophage fusion. Trends Cell Biol. 19 (10), 514-522 (2009).
- Podolnikova, N. P., Kushchayeva, Y. S., Wu, Y., Faust, J., Ugarova, T. P. The Role of Integrins α M β 2 (Mac-1, CD11b/CD18) and α D β 2 (CD11d/CD18) in Macrophage Fusion. Am J Pathol. 186 (8), 2105-2116 (2016).
- Faust, J. J., Christenson, W., Doudrick, K., Ros, R., Ugarova, T. P. Development of fusogenic glass surfaces that impart spatiotemporal control over macrophage fusion: Direct visualization of multinucleated giant cell formation. Biomaterials. 128, 160-171 (2017).
- Jenney, C. R., Anderson, J. M. Alkylsilane-modified surfaces: Inhibition of human macrophage adhesion and foreign body giant cell formation. J Biomed Mater Res. 46 (1), 11-21 (1999).
- Vignery, A. Methods to fuse macrophages in vitro. Cell Fusion: Overviews Methods. , 383-395 (2008).
- Zhao, Q., et al. Foreign-body giant cells and polyurethane biostability: In vivo correlation of cell adhesion and surface cracking. J Biomed Mater Res. 25 (2), 177-183 (1991).
- Anderson, J. M., Rodriguez, A., Chang, D. T. Foreign body reaction to biomaterials. Semin Immunol. 20 (2), 86-100 (2008).
- Jenney, C. R., Anderson, J. M. Effects of surface-coupled polyethylene oxide on human macrophage adhesion and foreign body giant cell formation in vitro. J Biomed Mater Res. 44 (2), 206-216 (1999).
- DeFife, K. M., Colton, E., Nakayama, Y., Matsuda, T., Anderson, J. M. Spatial regulation and surface chemistry control of monocyte/macrophage adhesion and foreign body giant cell formation by photochemically micropatterned surfaces. J Biomed Mater Res. 45 (2), 148-154 (1999).
- Jenney, C. R., DeFife, K. M., Colton, E., Anderson, J. M. Human monocyte/macrophage adhesion, macrophage motility, and IL-4-induced foreign body giant cell formation on silane-modified surfaces in vitro. J Biomed Mater Res. 41 (2), 171-184 (1998).
- Hell, S. W., Wichmann, J. Breaking the diffraction resolution limit by stimulated emission: stimulated-emission-depletion fluorescence microscopy. Opt Lett. 19 (11), 780-782 (1994).
- van de Linde, S., et al. Direct stochastic optical reconstruction microscopy with standard fluorescent probes. Nat Protocols. 6 (7), 991-1009 (2011).
- Fölling, J., et al. Fluorescence nanoscopy by ground-state depletion and single-molecule return. Nat Methods. 5 (11), 943-945 (2008).
- Heilemann, M., et al. Subdiffraction-resolution fluorescence imaging with conventional fluorescent probes. Ange Chem Int Edit. 47 (33), 6172-6176 (2008).
- Betzig, E. Proposed method for molecular optical imaging. Optics Letters. 20 (3), 237-239 (1995).
- Betzig, E., et al. Imaging intracellular fluorescent proteins at nanometer resolution. Science. 313 (5793), 1642-1645 (2006).
- Shtengel, G., et al. Interferometric fluorescent super-resolution microscopy resolves 3D cellular ultrastructure. P Natl Acad Sci U S A. 106 (9), 3125-3130 (2009).
- Shtengel, G., et al. Imaging cellular ultrastructure by PALM, iPALM, and correlative iPALM-EM. Method Cell Biol. 123, 273-294 (2013).
- Chen, B. C., et al. Lattice light-sheet microscopy: Imaging molecules to embryos at high spatiotemporal resolution. Science. 346 (6208), 1257998 (2014).
- Planchon, T. A., et al. Rapid three-dimensional isotropic imaging of living cells using Bessel beam plane illumination. Nat Methods. 8 (5), 417-423 (2011).
