Изготовления поверхностей оптическое качество стекла для изучения макрофагов Fusion
Summary
Этот протокол описывает изготовление оптического качества стеклянных поверхностей, адсорбированного с соединениями, содержащими длинноцепочечных углеводородов, которые могут использоваться для мониторинга макрофагов слияние живых образцов и позволяет суперразрешением микроскопии фиксированной образцов .
Abstract
Визуализация формирования многоядерные гигантские клетки (MGC) от живых образцов была сложной тем, что наиболее живой тепловизионные методы требуют распространения света через стекло, но на стекле макрофагов fusion-это редкое событие. Этот протокол представляет изготовление нескольких поверхностей оптическое качество стекла, где адсорбции соединений, содержащих длинные цепочки углеводородов превращает стекла в fusogenic поверхность. Во-первых описана подготовка поверхностей чистого стекла как исходный материал для модификации поверхности. Во-вторых метод предоставляется для адсорбции соединений, содержащих длинные цепочки углеводородов для преобразования не fusogenic стекло в подложке fusogenic. В-третьих этот протокол описывает изготовление поверхности micropatterns, которые способствуют высокой степенью пространственно-временных контроля над MGC формирования. Наконец изготовлении стекла дно блюда описан. Приведены примеры использования этой системы в vitro клетки в качестве модели для изучения фьюжн макрофагов и MGC формирования.
Introduction
Формирование MGC сопровождает ряд патологических состояний в организме человека отличаются хроническим воспалением1. Несмотря на соглашение, что макрофаги mononucleated предохранитель в форме MGC2, удивительно мало исследования показали фьюжн в контексте с живых образцов3,4. Это потому, что чистый стеклянных поверхностей, которые требуются для большинства методы визуализации не способствуют макрофагов фьюжн когда индуцированных воспалительных цитокинов5. Действительно если чистое стекло используется как субстрат для fusion макрофагов, затем низкого до среднего масштаба цели (т.е., X 10-20) и более чем 15 h непрерывного изображений часто требуется соблюдение одного сплавливание событие.
С другой стороны, fusogenic пластиковых поверхностей (например, permanox) или бактериологического пластика содействовать сплавливание2. Однако изображений через пластиковые проблематично, потому что подложки толщиной и рассеивает свет. Это осложняет, воображения, поскольку давно рабочих расстояние (LWD) целей требуются. Однако LWD целей обычно имеют низкой освещенности сбора потенциал, по сравнению с их coverslip исправлены коллегой. Кроме того методы, которые используют изменения полярности света, проходящего через образец как дифференциальной помехи контраст невозможно, поскольку пластик двулучепреломление. Барьеры, связанные с использованием пластиковых далее подчеркнули тот факт, что невозможно предсказать, где будет происходить макрофагов фьюжн/MGC формирование на поверхности. Вместе, эти ограничения ограничивают визуализации макрофагов сплавливание к фазе контраст Оптика, расширенный общей длительности визуализации (> 15 часов непрерывной) и низкого разрешения.
Недавно мы определили сильно fusogenic поверхности стекла во время проведения одной молекулы супер резолюции микроскопии с фиксированными макрофагов/MGC4. Это наблюдение было удивительно, потому что чистое стекло поверхности содействовать Фьюжн по очень низкой ставке ~ 5% после 24 часов в присутствии интерлейкина-4 (Ил-4) определяется сплавливание индекса4. Мы обнаружили, что способность содействовать сплавливание было обусловлено Олеамид загрязнения. Адсорбция Олеамид или других соединений, которые аналогичным образом содержатся углеводороды длинноцепочечных сделал fusogenic стекла. Большинство fusogenic соединения (парафин) был micropatterned, и он передал высокую степень пространственно-временных контроля над fusion макрофагов и 2 раза увеличение числа событий фьюжн, наблюдаемыми в такое же количество времени, по сравнению с permanox. Эти оптические качества поверхности представила первый проблеск в морфологические особенности и кинетики, которые регулируют формирования MGC в живых образцов.
В этом протоколе мы описываем изготовление различных стеклянных поверхностей, которые могут использоваться для мониторинга образования MGC из живых образцов. Кроме того мы показываем, что эти поверхности поддаются дальнего поля суперразрешением методов. Поверхности изготовление зависит от цели эксперимента, и каждая поверхность описан с соответствующих примеров в тексте разбирательства.
Protocol
Representative Results
Discussion
Необходимость выявления и впоследствии разработать оптическое качество стеклянных поверхностей, которые способствуют макрофагов фьюжн вытекает из того факта, что пока не недавно опубликованное исследование, непосредственно визуализировать фьюжн макрофагов в контексте жизни образ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы хотели бы поблагодарить членов Ugarova лаборатории и следователей в центре метаболических и сосудистая биология за полезные обсуждения этой работы. Джеймс Фауст хочет выразить свою благодарность инструкторы на курс Европейской лаборатории молекулярной биологии супер резолюции микроскопии в 2015 году. Мы хотели бы поблагодарить Сатья Khuon Janelia за помощь с Пробоподготовка для LLSM. В ходе обзора и съемок части этой работы Джеймс Фауст был поддержан T32 стипендий (5T32DK007569-28). Решетка свет лист компонент этой работы была поддержана HHMI и Гордон Мур фонд и Бетти. Т.ю. финансируется NIH Грант HL63199.
Materials
| Plasma cleaner | Harrick Plasma | PCD-32G | |
| Finder grid | Electron microscopy sciences | G400F1-Au | any gold TEM grid will work |
| Cover glass (22×22 mm) | Thor Labs | CG15CH | use only high stringency cover glass |
| Paraffin wax | Sigma Aldrich | 17310 | |
| Petrolatum | Sigma Aldrich | 16415 | must be α-tocopherol-free if substituted |
| Oleamide | Sigma Aldrich | O2136 | prepare fresh |
| Isopropanol | Sigma Aldrich | 278475 | |
| Toluene | Sigma Aldrich | 244511 | |
| Acetone | VWR International | BDH1101 | |
| Ethanol | Electron microscopy sciences | 15050 | use low dissolved solids ethanol |
| Hydrochloric acid | Fischer Scientific | A144C-212 | use to acid wash cover glass |
| Slyguard 184 | VWR International | 102092-312 | mix in a 1:10 ratio and cure at 50 °C for 4 h |
| 35 mm petri dish | Santa Cruz Biotech | sc-351864 | |
| Dumont no. 5 forceps | Electron microscopy sciences | 72705 | ideal for removing TEM grid in section 3.5 |
| FBS | Atlanta Biological | S11550 | |
| DMEM:F12 | Corning | 10-092 | contains 15 mM HEPES |
| Pen/Strept | Corning | 30-002-Cl | |
| HBSS | Corning | 21-023 | |
| BSA solution | Sigma Aldrich | A9576 | use at 0.1% in HBSS to wash non-adherent macrophages |
| IL-4 | Genscript | Z02996 | aliquot at 10 μg/mL and store at -20 °C |
| C57BL/6J | Jackson Laboratory | 000664 | use for fixed samples or techniques that do not require contrast agents |
| eGFP-LifeAct mice | n/a | n/a | use for live fluorescence imaging |
| Kimwipe | Kimberly Clark | 34155 | use to polish hydrocarbon adsorbed surfaces |
References
- McNally, A. K., Anderson, J. M. Interleukin-4 induces foreign body giant cells from human monocytes/macrophages. Differential lymphokine regulation of macrophage fusion leads to morphological variants of multinucleated giant cells. Am J Pathol. 147 (5), 1487 (1995).
- Helming, L., Gordon, S. Molecular mediators of macrophage fusion. Trends Cell Biol. 19 (10), 514-522 (2009).
- Podolnikova, N. P., Kushchayeva, Y. S., Wu, Y., Faust, J., Ugarova, T. P. The Role of Integrins α M β 2 (Mac-1, CD11b/CD18) and α D β 2 (CD11d/CD18) in Macrophage Fusion. Am J Pathol. 186 (8), 2105-2116 (2016).
- Faust, J. J., Christenson, W., Doudrick, K., Ros, R., Ugarova, T. P. Development of fusogenic glass surfaces that impart spatiotemporal control over macrophage fusion: Direct visualization of multinucleated giant cell formation. Biomaterials. 128, 160-171 (2017).
- Jenney, C. R., Anderson, J. M. Alkylsilane-modified surfaces: Inhibition of human macrophage adhesion and foreign body giant cell formation. J Biomed Mater Res. 46 (1), 11-21 (1999).
- Vignery, A. Methods to fuse macrophages in vitro. Cell Fusion: Overviews Methods. , 383-395 (2008).
- Zhao, Q., et al. Foreign-body giant cells and polyurethane biostability: In vivo correlation of cell adhesion and surface cracking. J Biomed Mater Res. 25 (2), 177-183 (1991).
- Anderson, J. M., Rodriguez, A., Chang, D. T. Foreign body reaction to biomaterials. Semin Immunol. 20 (2), 86-100 (2008).
- Jenney, C. R., Anderson, J. M. Effects of surface-coupled polyethylene oxide on human macrophage adhesion and foreign body giant cell formation in vitro. J Biomed Mater Res. 44 (2), 206-216 (1999).
- DeFife, K. M., Colton, E., Nakayama, Y., Matsuda, T., Anderson, J. M. Spatial regulation and surface chemistry control of monocyte/macrophage adhesion and foreign body giant cell formation by photochemically micropatterned surfaces. J Biomed Mater Res. 45 (2), 148-154 (1999).
- Jenney, C. R., DeFife, K. M., Colton, E., Anderson, J. M. Human monocyte/macrophage adhesion, macrophage motility, and IL-4-induced foreign body giant cell formation on silane-modified surfaces in vitro. J Biomed Mater Res. 41 (2), 171-184 (1998).
- Hell, S. W., Wichmann, J. Breaking the diffraction resolution limit by stimulated emission: stimulated-emission-depletion fluorescence microscopy. Opt Lett. 19 (11), 780-782 (1994).
- van de Linde, S., et al. Direct stochastic optical reconstruction microscopy with standard fluorescent probes. Nat Protocols. 6 (7), 991-1009 (2011).
- Fölling, J., et al. Fluorescence nanoscopy by ground-state depletion and single-molecule return. Nat Methods. 5 (11), 943-945 (2008).
- Heilemann, M., et al. Subdiffraction-resolution fluorescence imaging with conventional fluorescent probes. Ange Chem Int Edit. 47 (33), 6172-6176 (2008).
- Betzig, E. Proposed method for molecular optical imaging. Optics Letters. 20 (3), 237-239 (1995).
- Betzig, E., et al. Imaging intracellular fluorescent proteins at nanometer resolution. Science. 313 (5793), 1642-1645 (2006).
- Shtengel, G., et al. Interferometric fluorescent super-resolution microscopy resolves 3D cellular ultrastructure. P Natl Acad Sci U S A. 106 (9), 3125-3130 (2009).
- Shtengel, G., et al. Imaging cellular ultrastructure by PALM, iPALM, and correlative iPALM-EM. Method Cell Biol. 123, 273-294 (2013).
- Chen, B. C., et al. Lattice light-sheet microscopy: Imaging molecules to embryos at high spatiotemporal resolution. Science. 346 (6208), 1257998 (2014).
- Planchon, T. A., et al. Rapid three-dimensional isotropic imaging of living cells using Bessel beam plane illumination. Nat Methods. 8 (5), 417-423 (2011).
