Fabricación de superficies de cristal de calidad óptica para estudiar la fusión de macrófagos
Summary
Este protocolo describe la fabricación de las superficies de cristal de calidad óptica adsorbido con compuestos que contengan hidrocarburos de cadena larga que pueden ser utilizados para controlar la fusión de macrófagos de ejemplares vivos y permite la microscopía de superresolución de muestras fijas .
Abstract
Visualizar la formación de células gigantes multinucleadas (MGCs) de ejemplares vivos ha sido un desafío debido a que las técnicas de imagen más vivo requieren de propagación de la luz a través del vidrio, pero en vidrio fusión de macrófagos es un acontecimiento raro. Este protocolo presenta la fabricación de varias superficies de cristal de calidad óptica donde la adsorción de compuestos que contienen hidrocarburos de cadena larga transforma vidrio una superficie fusogénicas. En primer lugar, se describe la preparación de limpieza de superficies de vidrio como material para la modificación superficial de partida. En segundo lugar, un método se proporciona para la adsorción de compuestos que contienen hidrocarburos de cadena larga para convertir no fusogénicas vidrio en un substrato fusogénicas. En tercer lugar, este protocolo describe fabricación de micropatrones superficie que promueven un alto grado de control spatiotemporal sobre formación de MGC. Por último, se describe fabricación de platos de fondo de vidrio. Se muestran ejemplos de uso de este sistema de célula en vitro como un modelo para estudiar la fusión de macrófagos y la formación de MGC.
Introduction
La formación del MGCs acompaña a una serie de estados patológicos en el cuerpo humano caracterizado por inflamación crónica1. A pesar del acuerdo que mononucleated macrófagos se fusionan para formar MGCs2, sorprendentemente pocos estudios han demostrado fusión en contexto con vivas muestras de3,4. Esto es porque las superficies de vidrio limpio que se requieren para la mayoría de técnicas de imagen no favorecer la fusión de macrófagos cuando inducida por citoquinas inflamatorias5. De hecho, si limpio de vidrio se utiliza como sustrato para la fusión de macrófagos, luego baja a los objetivos de aumento intermedio (es decir, 10-20 X) y más de 15 h de continuo la proyección de imagen se requieren a menudo para observar un evento único fusion.
En la otra mano, fusogénicas las superficies de plástico (por ejemplo, permanox) o del plástico del grado bacteriológico promover fusión2. Sin embargo, la proyección de imagen a través del plástico es problemática porque el sustrato es grueso y dispersa la luz. Esto complica la proyección de imagen ya que requiere mucho trabajo objetivos de distancia (LWD). Sin embargo, objetivos LWD suelen tienen poca luz reuniendo capacidad en comparación con sus contrapartes cubreobjetos-corregida. Además, técnicas que aprovechan los cambios en la polaridad de luz que pasa a través de la muestra tales como contraste diferencial de interferencia son imposibles ya que el plástico es birrefringente. Las barreras asociadas al uso del plástico se destacaron aún más por el hecho de que es imposible predecir donde se producirá la formación de macrófagos fusión/MGC en la superficie. En conjunto, estas limitaciones restringen la visualización de la fusión de macrófagos a la óptica de contraste de fase, extendido duraciones imagen total (> 15 horas continuas) y baja resolución.
Recientemente se identificó una superficie altamente fusogénicas vidrio mientras realiza la microscopía de resolución super sola molécula con macrófagos fijos/MGCs4. Esta observación fue sorprendente porque limpiar vidrio superficies favorecer la fusión en la muy baja tasa de ~ 5% después de 24 h en presencia de Interleucina-4 (IL-4) según lo determinado por la fusión índice4. Se encontró que la capacidad de favorecer la fusión fue debido a la contaminación oleamide. Adsorción de oleamide u otros compuestos que igualmente contenían hidrocarburos de cadena larga hecha del vidrio fusogénicas. La mayoría fusogénicas compuesto (parafina) era micropatterned, e imparte un alto grado de control spatiotemporal sobre fusión de macrófagos y un aumento de 2 dobleces en el número de eventos de fusión observados dentro de la misma cantidad de tiempo en comparación con permanox. Estas superficies de calidad óptica proveyeron el primer vistazo a las características morfológicas y cinéticas que rigen la formación de MGCs en ejemplares vivos.
En este protocolo se describe la fabricación de una variedad de superficies de vidrio que pueden usarse para controlar la formación de MGCs de ejemplares vivos. Además, demostramos que estas superficies son susceptibles a las técnicas de resolución súper campo lejano. Fabricación superficial depende de la meta del experimento, y cada superficie se describe con ejemplos relacionados en el texto del procedimiento.
Protocol
Representative Results
Discussion
La necesidad de identificar y desarrollar posteriormente las superficies de cristal de calidad óptica que favorecer la fusión de macrófagos derivan del hecho de que hasta hace poco no publicarse directamente visualizada fusión de macrófagos en el contexto de la vida de muestras3, 4. Esto es debido a que fusogénicas superficies plásticas que se utilizan requieren objetivos LWD y son en gran parte limitadas a la óptica de contraste de fase. Estas barreras …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Queremos agradecer a miembros del laboratorio Ugarova y los investigadores en el centro de Biología Vascular y metabólica útil discusión de este trabajo. James Faust desea expresar su agradecimiento a los instructores en el curso de Biología Molecular europeo laboratorio Super resolución microscopia en 2015. Queremos agradecer los Satya Khuon en Janelia para ayuda con la preparación de muestras para LLSM. Durante la revisión y rodajes porciones de este trabajo James Faust fue apoyado por una beca de T32 (5T32DK007569-28). El componente de hoja de luz de celosía de este trabajo fue apoyado por el HHMI y la Betty y Gordon Moore Foundation. T.U. es financiado por los NIH grant HL63199.
Materials
| Plasma cleaner | Harrick Plasma | PCD-32G | |
| Finder grid | Electron microscopy sciences | G400F1-Au | any gold TEM grid will work |
| Cover glass (22×22 mm) | Thor Labs | CG15CH | use only high stringency cover glass |
| Paraffin wax | Sigma Aldrich | 17310 | |
| Petrolatum | Sigma Aldrich | 16415 | must be α-tocopherol-free if substituted |
| Oleamide | Sigma Aldrich | O2136 | prepare fresh |
| Isopropanol | Sigma Aldrich | 278475 | |
| Toluene | Sigma Aldrich | 244511 | |
| Acetone | VWR International | BDH1101 | |
| Ethanol | Electron microscopy sciences | 15050 | use low dissolved solids ethanol |
| Hydrochloric acid | Fischer Scientific | A144C-212 | use to acid wash cover glass |
| Slyguard 184 | VWR International | 102092-312 | mix in a 1:10 ratio and cure at 50 °C for 4 h |
| 35 mm petri dish | Santa Cruz Biotech | sc-351864 | |
| Dumont no. 5 forceps | Electron microscopy sciences | 72705 | ideal for removing TEM grid in section 3.5 |
| FBS | Atlanta Biological | S11550 | |
| DMEM:F12 | Corning | 10-092 | contains 15 mM HEPES |
| Pen/Strept | Corning | 30-002-Cl | |
| HBSS | Corning | 21-023 | |
| BSA solution | Sigma Aldrich | A9576 | use at 0.1% in HBSS to wash non-adherent macrophages |
| IL-4 | Genscript | Z02996 | aliquot at 10 μg/mL and store at -20 °C |
| C57BL/6J | Jackson Laboratory | 000664 | use for fixed samples or techniques that do not require contrast agents |
| eGFP-LifeAct mice | n/a | n/a | use for live fluorescence imaging |
| Kimwipe | Kimberly Clark | 34155 | use to polish hydrocarbon adsorbed surfaces |
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