Fabrication de Surfaces de verre de qualité optique pour étudier la Fusion des macrophages
Summary
Ce protocole décrit la fabrication de surfaces de verre de qualité optique adsorbé avec des composés contenant des hydrocarbures à chaîne longue qui peuvent être utilisés pour surveiller la fusion des macrophages de spécimens vivants et permet de microscopie de Super-résolution d’échantillons fixés .
Abstract
Visualisation de la formation de cellules géantes multinucléées (MSG) de spécimens vivants a été difficile due au fait que plus les techniques d’imagerie live nécessitent de propagation de la lumière à travers le verre, mais sur verre fusion des macrophages est un événement rare. Ce protocole présente la fabrication de plusieurs surfaces de verre de qualité optique où adsorption des composés contenant des hydrocarbures à chaîne longue transforme verre en une surface coniques. Tout d’abord, la préparation des surfaces de verre propre comme matériau pour la modification de la surface de départ est décrite. En second lieu, une méthode est fournie pour l’adsorption des composés contenant des hydrocarbures à chaîne longue pour convertir les non-coniques verre en un substrat coniques. Troisièmement, ce protocole décrit fabrication de surface micropatterns qui favorisent un degré élevé de maîtrise spatio-temporelle de formation MGC. Enfin, la fabrication de vaisselle en verre bas est décrite. Des exemples d’utilisation de ce système de cellules in vitro comme modèle pour étudier la fusion des macrophages et formation MGC sont montrés.
Introduction
La formation de MSG accompagne un certain nombre d’états pathologiques dans le corps humain se distingue par une inflammation chronique1. Malgré l’accord qui les macrophages mononucléés se fusionnent pour former MSG2, étonnamment peu d’études ont montré de fusion dans le contexte de vie des spécimens de3,4. C’est parce que les surfaces de verre propre qui sont requis pour la plupart des techniques d’imagerie ne favorisent pas la fusion des macrophages quand induit par des cytokines inflammatoires5. En effet, si le verre propre est utilisé comme substrat pour la fusion des macrophages, puis faible aux objectifs intermédiaires de grossissement (c.-à-d., X 10-20) et plus de 15 h de continu imagerie doivent souvent d’observer un événement unique fusion.
Sur l’autre main, les surfaces en plastique coniques (p. ex., permanox) ou plastique qualité bactériologique promouvoir fusion2. Toutefois, l’imagerie par le biais de plastique est problématique car le substrat est épais et disperse la lumière. Ce qui complique l’imagerie depuis longtemps des objectifs de distance (LWD) de travail sont nécessaires. Toutefois, les objectifs de GDL ont habituellement basse lumière rassemblant la capacité par rapport à leurs homologues de la lamelle couvre-objet-corrigé. En outre, techniques qui exploitent des changements dans la polarité de la lumière passant à travers l’échantillon comme le contraste interférentiel différentiel sont impossibles, car le plastique est biréfringent. Les obstacles liés à l’utilisation de plastique sont encore soulignées par le fait qu’il est impossible de prédire où formation fusion/MGC macrophage se produira sur la surface. Ensemble, ces restrictions limitent la visualisation de la fusion des macrophages à l’optique de contraste de phase, étendue des durées d’imagerie totales (> 15 heures consécutives) et en basse résolution.
Récemment, nous avons identifié une surface de verre hautement fusogène tout en menant la microscopie seule molécule Super-résolution avec macrophages fixes/MSG4. Cette observation a été surprenant parce que nettoyer le verre surfaces promouvoir fusion au très faible taux de ~ 5 % après 24 h en présence de l’interleukine-4 (IL-4), tel que déterminé par la fusion de l’index4. Nous avons constaté que la capacité à promouvoir la fusion était due à la contamination de l’olΘamide. Adsorption d’olΘamide ou d’autres composés contenant de la même façon les hydrocarbures à chaîne longue fait le verre coniques. La plupart fusogène composé (paraffine) a été MICROIMPRIMEES, et il donnait un haut degré de contrôle spatio-temporelle sur fusion des macrophages et une augmentation de 2 fois le nombre d’événements de fusion observée dans le même laps de temps par rapport à permanox. Ces surfaces de qualité optique a fourni le premier coup de œil sur les caractéristiques morphologiques et cinétique qui régissent la formation des MSG dans les spécimens vivants.
Dans ce protocole, nous décrivons la fabrication d’une variété de surfaces de verre qui peut être utilisé pour suivre la formation de MSG de spécimens vivants. En outre, nous montrons que ces surfaces soient prêtent à des techniques de champ lointain Super-résolution. Fabrication de surface dépend de l’objectif de l’expérience, et chaque surface est décrite avec des exemples dans le texte de la procédure.
Protocol
Representative Results
Discussion
La nécessité d’identifier et de développer par la suite les surfaces de verre de qualité optique qui favorisent la fusion des macrophages découlait du fait que, jusqu’à l’étude non publiée récemment directement visualisé la fusion des macrophages dans le cadre de vie des spécimens3, 4. Cela est dû au fait que fusogène surfaces plastiques qui sont couramment utilisés nécessitent objectifs GDL et sont en grande partie limitées à l’optique de…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nous tenons à remercier les membres du laboratoire de Ugarova et chercheurs au centre de métabolisme et de la biologie vasculaire pour une discussion utile de ce travail. Faust de James tient à exprimer sa gratitude pour les instructeurs du cours de l’European Molecular Biology Laboratory Super résolution microscopie en 2015. Nous tenons à remercier Satya Khuon Janelia pour aide à la préparation de l’échantillon pour LLSM. Au cours de l’examen et le tournage des parties de ce document, James Faust était soutenue par une bourse T32 (5T32DK007569-28). Le composant de feuille de lumière de treillis de ce travail a été soutenu par HHMI et Betty et Gordon Moore Foundation. T.U. est financé par les NIH grant HL63199.
Materials
| Plasma cleaner | Harrick Plasma | PCD-32G | |
| Finder grid | Electron microscopy sciences | G400F1-Au | any gold TEM grid will work |
| Cover glass (22×22 mm) | Thor Labs | CG15CH | use only high stringency cover glass |
| Paraffin wax | Sigma Aldrich | 17310 | |
| Petrolatum | Sigma Aldrich | 16415 | must be α-tocopherol-free if substituted |
| Oleamide | Sigma Aldrich | O2136 | prepare fresh |
| Isopropanol | Sigma Aldrich | 278475 | |
| Toluene | Sigma Aldrich | 244511 | |
| Acetone | VWR International | BDH1101 | |
| Ethanol | Electron microscopy sciences | 15050 | use low dissolved solids ethanol |
| Hydrochloric acid | Fischer Scientific | A144C-212 | use to acid wash cover glass |
| Slyguard 184 | VWR International | 102092-312 | mix in a 1:10 ratio and cure at 50 °C for 4 h |
| 35 mm petri dish | Santa Cruz Biotech | sc-351864 | |
| Dumont no. 5 forceps | Electron microscopy sciences | 72705 | ideal for removing TEM grid in section 3.5 |
| FBS | Atlanta Biological | S11550 | |
| DMEM:F12 | Corning | 10-092 | contains 15 mM HEPES |
| Pen/Strept | Corning | 30-002-Cl | |
| HBSS | Corning | 21-023 | |
| BSA solution | Sigma Aldrich | A9576 | use at 0.1% in HBSS to wash non-adherent macrophages |
| IL-4 | Genscript | Z02996 | aliquot at 10 μg/mL and store at -20 °C |
| C57BL/6J | Jackson Laboratory | 000664 | use for fixed samples or techniques that do not require contrast agents |
| eGFP-LifeAct mice | n/a | n/a | use for live fluorescence imaging |
| Kimwipe | Kimberly Clark | 34155 | use to polish hydrocarbon adsorbed surfaces |
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