マクロファージの融合を研究するための光学的品質ガラス表面を加工
Summary
このプロトコルを記述する生きている標本のマクロファージの融合の監視に使用することができ、固定標本の超解像顕微鏡の長鎖炭化水素を含む化合物を吸着した光学的品質のガラス表面の作製.
Abstract
生きている標本から巨細胞 (MGCs) の形成の可視化という最もライブ イメージング技術は、ガラスを光の伝搬を必要とするが、ガラスにマクロファージの融合は、まれなイベントのためにチャレンジしております。このプロトコルは、長鎖炭化水素を含む化合物の吸着が融合性表面にガラスを変換いくつかの光学的品質のガラス表面の作製を提示します。まず、きれいなガラス表面処理表面改質の出発原料として、説明します。第二に、融合性基板非融合性ガラスに変換する長鎖炭化水素を含む化合物の吸着のメソッドが提供されます。第三に、このプロトコルでは、MGC 形成の時空間制御の高度を促進するため表面のマイクロ パターンの作製について説明します。最後に、ガラス底培養皿を製造すると説明します。マクロファージの融合や MGC 形成を研究するモデルとしてこの体外電池システムの使用の例を示します。
Introduction
MGCs の形成に伴う慢性炎症1識別人体病理学的状態の数。Mononucleated マクロファージ ヒューズ フォーム MGCs2に合意、にもかかわらず意外にも少数の研究は、生活の文脈の中融合を示している標本3,4。ほとんどイメージングに必要なきれいなガラス表面はマクロファージの融合による炎症性サイトカイン5時を促進しないためにです。確かに、きれいなガラスとして使用する場合、基板、マクロファージの融合中間倍率の目的 (すなわち10-20 X) 及び連続 15 時間以上低画像多くの場合単一の融合イベントを観察するに必要があります。
その他の手、融合性プラスチック表面 (例えばpermanox) または細菌学的グレードのプラスチックにフュージョン2を促進します。しかし、プラスチックを通してイメージングは、基板が厚いと光が飛び散るので問題です。これはイメージング長い作動距離 (LWD) 対物レンズが必要なので複雑になります。ただし、LWD 目標通常収集能力と比べて、coverslip 修正、低光があります。さらに、以来、プラスチックの複屈折、微分干渉コントラストなど試料を通過する光の極性の変化を利用する技術が可能。プラスチックの使用に伴う障壁をそれはマクロファージの融合/MGC 形成が表面に発生する個所を予測することが可能ではないという事実によってさらに強調しました。一緒に、これらの制限は、段階の対照の光学、合計イメージング期間を拡張するマクロファージの融合の可視化を制限する (> 15 連続時間)、および低解像度。
最近マクロファージ/MGCs4分子超解像顕微鏡観察を行いながら高い融合性のガラス表面がわかりました。この観測された意外なのできれいにガラス表面の非常に低いレートで融合を促進する 〜 インターロイキン 4 (IL-4) 融合によって決定される存在下で 24 時間後 5% インデックス4。融合を促進するために容量がオレアミドの汚染が原因だったことがわかった。オレアミドまたは同様に長鎖炭化水素に含まれているその他の化合物の吸着したガラス膜融合。ほとんど融合ペプチド化合物 (パラフィン ワックス) マイクロパターニングゲル、それはマクロファージの融合と permanox と比較して同じ時間内で観測された融合イベントの数の 2 倍増加を時空間制御の高度を与えられます。これらの光学的品質の表面は形態学的特徴と生きている標本の MGCs 形成カイネティクスに最初の一見を提供しました。
このプロトコルの様々 な MGCs の生きている標本からの形成を監視するために使用できるガラス表面の作製について述べる。さらに、これらのサーフェスが遠方の超解像技術に従う義務があることを示します。表面加工は、実験の目的に依存して、各サーフェスは、進むテキストの関連の例で説明。
Protocol
Representative Results
Discussion
識別し、その後、マクロファージの融合を促進するため、光学的品質のガラス表面を開発する必要が最近ない出版された調査直接まで生活のコンテキストでマクロファージの融合を可視化という事実から生じた試験片3、 4。これは、一般的に使用される融合性プラスチック表面 LWD 目標を必要し、する大部分の段階の対照の光学に制限されますが原…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
私たちはこの仕事の役に立つ議論のための代謝と血管生物学 Ugarova 研究所、センターの研究者のメンバーに感謝したいと思います。ジェームズ ・ ファウストは、2015 年に欧州分子生物学研究所超解像顕微鏡法コースでインストラクターに感謝の意を表現する願っています。Janelia で LLSM のサンプル準備のヘルプについてサティヤ Khuon に感謝したいです。レビューとこの作品の撮影の部分の間にジェームズ ・ ファウストは T32 フェローシップ (5T32DK007569-28) によって支えられました。この作品の格子光シート コンポーネントは HHMI およびベティとゴードン ・ ムーア財団によって支えられました。顧問は、NIH によって資金を供給 HL63199 を付与します。
Materials
| Plasma cleaner | Harrick Plasma | PCD-32G | |
| Finder grid | Electron microscopy sciences | G400F1-Au | any gold TEM grid will work |
| Cover glass (22×22 mm) | Thor Labs | CG15CH | use only high stringency cover glass |
| Paraffin wax | Sigma Aldrich | 17310 | |
| Petrolatum | Sigma Aldrich | 16415 | must be α-tocopherol-free if substituted |
| Oleamide | Sigma Aldrich | O2136 | prepare fresh |
| Isopropanol | Sigma Aldrich | 278475 | |
| Toluene | Sigma Aldrich | 244511 | |
| Acetone | VWR International | BDH1101 | |
| Ethanol | Electron microscopy sciences | 15050 | use low dissolved solids ethanol |
| Hydrochloric acid | Fischer Scientific | A144C-212 | use to acid wash cover glass |
| Slyguard 184 | VWR International | 102092-312 | mix in a 1:10 ratio and cure at 50 °C for 4 h |
| 35 mm petri dish | Santa Cruz Biotech | sc-351864 | |
| Dumont no. 5 forceps | Electron microscopy sciences | 72705 | ideal for removing TEM grid in section 3.5 |
| FBS | Atlanta Biological | S11550 | |
| DMEM:F12 | Corning | 10-092 | contains 15 mM HEPES |
| Pen/Strept | Corning | 30-002-Cl | |
| HBSS | Corning | 21-023 | |
| BSA solution | Sigma Aldrich | A9576 | use at 0.1% in HBSS to wash non-adherent macrophages |
| IL-4 | Genscript | Z02996 | aliquot at 10 μg/mL and store at -20 °C |
| C57BL/6J | Jackson Laboratory | 000664 | use for fixed samples or techniques that do not require contrast agents |
| eGFP-LifeAct mice | n/a | n/a | use for live fluorescence imaging |
| Kimwipe | Kimberly Clark | 34155 | use to polish hydrocarbon adsorbed surfaces |
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