मैक्रोफेज फ्यूजन का अध्ययन करने के लिए ऑप्टिकल-गुणवत्ता कांच सतहों बनाना
Summary
इस प्रोटोकॉल के निर्माण का वर्णन करता है ऑप्टिकल गुणवत्ता कांच यौगिकों जिसमें रहने वाले नमूनों की मैक्रोफेज संलयन पर नजर रखने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है और निश्चित नमूनों की सुपर संकल्प माइक्रोस्कोपी के लिए सक्षम बनाता है युक्त लंबी श्रृंखला हाइड्रोकार्बन के साथ adsorbed सतहों .
Abstract
नमूनों रहने से multinucleated विशाल कोशिकाओं (MGCs) के गठन visualizing तथ्य यह है कि ज्यादातर लाइव इमेजिंग तकनीक कांच के माध्यम से प्रकाश के प्रसार की आवश्यकता के कारण चुनौतीपूर्ण है, लेकिन कांच मैक्रोफेज फ्यूजन पर एक दुर्लभ घटना है । इस प्रोटोकॉल कई ऑप्टिकल गुणवत्ता कांच सतहों का निर्माण प्रस्तुत करता है, जहां लंबी श्रृंखला हाइड्रोकार्बन युक्त यौगिकों के सोखना एक fusogenic सतह में कांच बदल जाता है । पहले, सतह संशोधन के लिए शुरू सामग्री के रूप में साफ गिलास सतहों की तैयारी वर्णित है । दूसरा, एक विधि एक fusogenic सब्सट्रेट में गैर fusogenic ग्लास परिवर्तित करने के लिए लंबी श्रृंखला हाइड्रोकार्बन युक्त यौगिकों के सोखना के लिए प्रदान की जाती है । तीसरा, इस प्रोटोकॉल सतह micropatterns कि MGC गठन पर spatiotemporal नियंत्रण के एक उच्च डिग्री को बढ़ावा देने के निर्माण का वर्णन है । अंत में, कांच के नीचे व्यंजन बनाना वर्णन किया गया है । मैक्रोफेज फ्यूजन और MGC गठन का अध्ययन करने के लिए एक मॉडल के रूप में इन विट्रो सेल प्रणाली के उपयोग के उदाहरण दिखाए जाते हैं ।
Introduction
MGCs के गठन जीर्ण सूजन1द्वारा प्रतिष्ठित मानव शरीर में रोग राज्यों की एक संख्या के साथ जुडा हुआ है । समझौते के बावजूद कि mononucleated मैक्रोफेज फ्यूज MGCs2फार्म, आश्चर्यजनक रूप से कुछ अध्ययनों के संदर्भ में फ्यूजन रहने वाले नमूनों के साथ दिखाया गया है3,4. यह इसलिए है क्योंकि स्वच्छ कांच सतहों कि सबसे इमेजिंग तकनीकों के लिए आवश्यक है मैक्रोफेज फ्यूजन को बढ़ावा देने जब भड़काऊ साइटोकिंस द्वारा प्रेरित नहीं है5। वास्तव में, यदि स्वच्छ कांच मैक्रोफेज संलयन के लिए एक सब्सट्रेट के रूप में प्रयोग किया जाता है, तो कम से मध्यम आवर्धन उद्देश्यों (यानी, 10-20X) और निरंतर इमेजिंग के 15 से अधिक एच अक्सर एक एकल संलयन घटना का पालन करने की आवश्यकता है ।
दूसरी ओर, fusogenic प्लास्टिक सतहों (जैसे, permanox) या जीवाणु ग्रेड प्लास्टिक को बढ़ावा देने के फ्यूजन2। हालांकि, प्लास्टिक के माध्यम से इमेजिंग समस्याग्रस्त है क्योंकि सब्सट्रेट मोटी है और प्रकाश तितर बितर । यह पेचीदा इमेजिंग के बाद से लंबे समय से काम दूरी (LWD) उद्देश्यों की आवश्यकता है । हालांकि, LWD उद्देश्यों आमतौर पर कम प्रकाश सभा क्षमता उनके coverslip-समकक्ष सही की तुलना में है । इसके अलावा, तकनीक है कि इस तरह के अंतर हस्तक्षेप के विपरीत के रूप में नमूना के माध्यम से गुजर प्रकाश की ध्रुवीयता में परिवर्तन का फायदा उठाने के बाद से प्लास्टिक birefringent है असंभव है । प्लास्टिक के उपयोग के साथ जुड़े बाधाओं को आगे तथ्य यह है कि यह कहां मैक्रोफेज फ्यूजन/MGC गठन सतह पर हो जाएगा भविष्यवाणी करने के लिए असंभव है द्वारा रेखांकित कर रहे हैं । साथ में, इन सीमाओं मैक्रोफेज संलयन के दृश्य को सीमित करने के लिए चरण कंट्रास्ट प्रकाशिकी, विस्तारित कुल इमेजिंग अवधि (> 15 निरंतर घंटे), और कम संकल्प ।
हम हाल ही में एक अत्यधिक fusogenic कांच की सतह की पहचान की है जबकि फिक्स्ड मैक्रोफेज/MGCs4के साथ एकल अणु सुपर संकल्प माइक्रोस्कोपी का आयोजन. इस अवलोकन आश्चर्य की बात है क्योंकि साफ गिलास सतहों के बहुत कम दर पर संलयन को बढ़ावा देने के ~ 5% interleukin की उपस्थिति में 24 घंटे के बाद-4 (IL-4) के रूप में फ्यूजन सूचकांक4द्वारा निर्धारित है । हमने पाया कि फ्यूजन को बढ़ावा देने की क्षमता oleamide संदूषण के कारण थी । oleamide या अंय यौगिकों कि इसी तरह लंबी श्रृंखला हाइड्रोकार्बन निहित की सोखना ग्लास fusogenic बनाया है । सबसे fusogenic यौगिक (आयल मोम) micropatterned था, और यह मैक्रोफेज फ्यूजन पर spatiotemporal नियंत्रण के एक उच्च डिग्री प्रदान की और एक 2-फ्यूजन की घटनाओं की संख्या में वृद्धि गुना permanox की तुलना में समय की एक ही राशि के भीतर मनाया । इन ऑप्टिकल गुणवत्ता सतहों रूपात्मक सुविधाओं और कैनेटीक्स कि नमूनों में रहने वाले MGCs के गठन को नियंत्रित में पहली झलक प्रदान की है ।
इस प्रोटोकॉल में हम कांच सतहों कि रहने वाले नमूनों से MGCs के गठन की निगरानी करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है की एक किस्म के निर्माण का वर्णन । इसके अलावा, हम बताते हैं कि इन सतहों दूर क्षेत्र सुपर संकल्प तकनीक के लिए उत्तरदायी हैं. सतह निर्माण प्रयोग के लक्ष्य पर निर्भर है, और प्रत्येक सतह को आगे बढ़ने के पाठ में संबंधित उदाहरणों के साथ वर्णित है ।
Protocol
Representative Results
Discussion
की पहचान करने के लिए और बाद में ऑप्टिकल गुणवत्ता कांच सतहों कि मैक्रोफेज फ्यूजन को बढ़ावा देने की जरूरत है कि हाल ही में जब तक कोई प्रकाशित नहीं अध्ययन सीधे रहने वाले नमूनों के संदर्भ में मैक्रोफेज संल?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
हम इस काम के लिए उपयोगी चर्चा के लिए चयापचय और संवहनी जीवविज्ञान के लिए केंद्र में Ugarova प्रयोगशाला और जांचकर्ताओं के सदस्यों को धंयवाद देना चाहते हैं । जेम्स Faust ने 2015 में यूरोपीय आणविक जीवविज्ञान प्रयोगशाला सुपर रेजोल्यूशन माइक्रोस्कोपी कोर्स में प्रशिक्षकों के प्रति अपना आभार व्यक्त करना चाहता है । हम LLSM के लिए नमूना तैयारी के साथ मदद के लिए Janelia पर सत्य Khuon शुक्रिया अदा करना चाहता हूं । समीक्षा और इस काम के अंश फिल्माने के दौरान जेम्स Faust को एक T32 फेलोशिप (5T32DK007569-28) द्वारा सपोर्ट किया गया । इस काम के जाली प्रकाश शीट घटक HHMI और बेटी और गॉर्डन मूर फाउंडेशन द्वारा समर्थित किया गया था । T.U. NIH अनुदान HL63199 द्वारा वित्त पोषित है ।
Materials
| Plasma cleaner | Harrick Plasma | PCD-32G | |
| Finder grid | Electron microscopy sciences | G400F1-Au | any gold TEM grid will work |
| Cover glass (22×22 mm) | Thor Labs | CG15CH | use only high stringency cover glass |
| Paraffin wax | Sigma Aldrich | 17310 | |
| Petrolatum | Sigma Aldrich | 16415 | must be α-tocopherol-free if substituted |
| Oleamide | Sigma Aldrich | O2136 | prepare fresh |
| Isopropanol | Sigma Aldrich | 278475 | |
| Toluene | Sigma Aldrich | 244511 | |
| Acetone | VWR International | BDH1101 | |
| Ethanol | Electron microscopy sciences | 15050 | use low dissolved solids ethanol |
| Hydrochloric acid | Fischer Scientific | A144C-212 | use to acid wash cover glass |
| Slyguard 184 | VWR International | 102092-312 | mix in a 1:10 ratio and cure at 50 °C for 4 h |
| 35 mm petri dish | Santa Cruz Biotech | sc-351864 | |
| Dumont no. 5 forceps | Electron microscopy sciences | 72705 | ideal for removing TEM grid in section 3.5 |
| FBS | Atlanta Biological | S11550 | |
| DMEM:F12 | Corning | 10-092 | contains 15 mM HEPES |
| Pen/Strept | Corning | 30-002-Cl | |
| HBSS | Corning | 21-023 | |
| BSA solution | Sigma Aldrich | A9576 | use at 0.1% in HBSS to wash non-adherent macrophages |
| IL-4 | Genscript | Z02996 | aliquot at 10 μg/mL and store at -20 °C |
| C57BL/6J | Jackson Laboratory | 000664 | use for fixed samples or techniques that do not require contrast agents |
| eGFP-LifeAct mice | n/a | n/a | use for live fluorescence imaging |
| Kimwipe | Kimberly Clark | 34155 | use to polish hydrocarbon adsorbed surfaces |
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