Fabrikere optisk-kvalitet barometer overflater å studere Macrophage Fusion
Summary
Denne protokollen beskriver fabrikasjon av optisk-kvalitet barometer overflater adsorbert med forbindelser som inneholder langkjedede hydrokarboner som kan brukes til å overvåke macrophage blanding av levende og aktiverer super-oppløsning mikroskopi av fast .
Abstract
Visualisere dannelsen av multinucleated gigantiske celler (MGCs) fra levende prakteksemplarer har vært utfordrende på grunn av det faktum at mest levende Bildeteknikker krever overføring av lys gjennom glass, men på glass macrophage fusion er en sjelden begivenhet. Denne protokollen presenterer fabrikasjon av flere optisk-kvalitet barometer overflater der adsorpsjon av forbindelser som inneholder langkjedede hydrokarboner forvandler glass i en fusogenic overflate. Først er utarbeidelse av ren glassflater som starter materiale for overflate endring beskrevet. Andre tilbys en metode for opptak av forbindelser som inneholder langkjedede hydrokarboner å konvertere ikke-fusogenic glass til en fusogenic substrat. Tredje beskriver denne protokollen fabrikasjon av overflaten micropatterns som fremmer en høy grad av spatiotemporal kontroll over MGC formasjon. Til slutt, fabrikasjon glass bunn retter er beskrevet. Eksempler på bruk av dette i vitro cellen systemet som modell macrophage fusion og MGC formasjon vises.
Introduction
Dannelsen av MGCs følger en rekke patologiske tilstander i menneskekroppen atskilt av kronisk betennelse1. Til tross for avtalen at mononucleated makrofager sikringen skjemaet MGCs2, overraskende få studier har vist fusion i sammenheng med levende prakteksemplarer3,4. Dette er fordi ren glassflater som kreves for de fleste Bildeteknikker ikke forfremmes macrophage fusion når indusert av inflammatoriske cytokiner5. Faktisk hvis ren glass er brukt som et medium for macrophage fusion, så lav til middels forstørrelse mål (dvs, 10-20 X) og mer enn 15 timer kontinuerlig imaging er ofte nødvendig å observere en enkelt fusion hendelse.
På den andre hånden, fusogenic plast overflater (f.eks, permanox) eller bakteriologiske grade plastikk fremme fusion2. Men er imaging gjennom plast problematisk fordi underlaget er tykk og sprer lyset. Dette kompliserer imaging siden lenge arbeider avstand (LWD) mål er nødvendig. LWD mål har imidlertid vanligvis lite lys samle kapasitet i forhold til deres dekkglassvæske-korrigert motpart. Videre er teknikker utnytte endringer i polariteten til lyset passerer prøven som differensial forstyrrelser kontrast umulig siden plast er birefringent. Barrierer forbundet med bruk av plast er ytterligere understreket av det faktum at det er umulig å forutsi hvor macrophage fusion/MGC formasjon plasseres på overflaten. Sammen disse begrensninger begrense visualisering av macrophage fusion å fase kontrast optikk, utvidet totale tenkelig varighet (> 15 sammenhengende timer), og lav oppløsning.
Vi har nylig identifisert en svært fusogenic glassoverflate mens drive enkelt-molekylet super-oppløsning mikroskopi med fast makrofager/MGCs4. Denne observasjonen var overraskende fordi ren glass overflater fremme fusion ved svært lav hastighet på ~ 5% etter 24 timer i nærvær av interleukin-4 (IL-4) etter fusjon indeks4. Vi fant at evnen til å fremme fusion skyldtes oleamide forurensning. Adsorpsjon av oleamide eller andre forbindelser som tilsvarende langkjedede hydrokarboner gjort glass fusogenic. Den mest fusogenic sammensatte (parafin voks) var micropatterned, og den formidles en høy grad av spatiotemporal kontroll over macrophage fusion og en 2-fold økning i antall fusion hendelser observert i samme mengde tid i forhold til permanox. Overflatene optisk kvalitet gitt den første glimt inn i morfologiske funksjoner og kinetics som styrer dannelsen av MGCs i levende prøver.
I denne protokollen beskriver vi fabrikasjon av en rekke glassflater som kan brukes til å overvåke dannelsen av MGCs fra levende prøver. I tillegg viser vi at disse områdene er mottakelig for langt-feltet super-oppløsning teknikker. Overflaten fabrikasjon er avhengig av målet for eksperimentet, og hver overflate er beskrevet med relaterte eksempler i fortsetter teksten.
Protocol
Representative Results
Discussion
Behovet for å identifisere og deretter utvikle optisk-kvalitet barometer overflater som fremmer macrophage fusion stammet fra det faktum at inntil nylig ingen publiserte studien direkte visualisert macrophage fusjon i kontekst av levende prakteksemplarer3, 4. Dette er på grunn av at fusogenic plast overflater som brukes ofte krever LWD mål og er begrenset til fase kontrast optikk. Disse barrierene ble overvunnet av engineering en optisk-kvalitet barometer ove…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi ønsker å takke medlemmer av Ugarova laboratorium og etterforskere i sentrum for metabolske og Vascular biologi nyttig informasjon om dette arbeidet. James Faust ønsker å uttrykke sin takknemlighet til instruktører ved European Molecular Biology Laboratory Super-oppløsning mikroskopi kurset i 2015. Vi ønsker å takke Satya Khuon på Janelia for hjelp med eksempel forberedelse til LLSM. Under gjennomgang og filming deler av dette arbeidet ble James Faust støttet av en T32 fellesskap (5T32DK007569-28). Komponenten gitter lys ark av dette arbeidet ble støttet av HHMI og Betty og Gordon Moore Foundation. T.U. er finansiert av NIH gi HL63199.
Materials
| Plasma cleaner | Harrick Plasma | PCD-32G | |
| Finder grid | Electron microscopy sciences | G400F1-Au | any gold TEM grid will work |
| Cover glass (22×22 mm) | Thor Labs | CG15CH | use only high stringency cover glass |
| Paraffin wax | Sigma Aldrich | 17310 | |
| Petrolatum | Sigma Aldrich | 16415 | must be α-tocopherol-free if substituted |
| Oleamide | Sigma Aldrich | O2136 | prepare fresh |
| Isopropanol | Sigma Aldrich | 278475 | |
| Toluene | Sigma Aldrich | 244511 | |
| Acetone | VWR International | BDH1101 | |
| Ethanol | Electron microscopy sciences | 15050 | use low dissolved solids ethanol |
| Hydrochloric acid | Fischer Scientific | A144C-212 | use to acid wash cover glass |
| Slyguard 184 | VWR International | 102092-312 | mix in a 1:10 ratio and cure at 50 °C for 4 h |
| 35 mm petri dish | Santa Cruz Biotech | sc-351864 | |
| Dumont no. 5 forceps | Electron microscopy sciences | 72705 | ideal for removing TEM grid in section 3.5 |
| FBS | Atlanta Biological | S11550 | |
| DMEM:F12 | Corning | 10-092 | contains 15 mM HEPES |
| Pen/Strept | Corning | 30-002-Cl | |
| HBSS | Corning | 21-023 | |
| BSA solution | Sigma Aldrich | A9576 | use at 0.1% in HBSS to wash non-adherent macrophages |
| IL-4 | Genscript | Z02996 | aliquot at 10 μg/mL and store at -20 °C |
| C57BL/6J | Jackson Laboratory | 000664 | use for fixed samples or techniques that do not require contrast agents |
| eGFP-LifeAct mice | n/a | n/a | use for live fluorescence imaging |
| Kimwipe | Kimberly Clark | 34155 | use to polish hydrocarbon adsorbed surfaces |
References
- McNally, A. K., Anderson, J. M. Interleukin-4 induces foreign body giant cells from human monocytes/macrophages. Differential lymphokine regulation of macrophage fusion leads to morphological variants of multinucleated giant cells. Am J Pathol. 147 (5), 1487 (1995).
- Helming, L., Gordon, S. Molecular mediators of macrophage fusion. Trends Cell Biol. 19 (10), 514-522 (2009).
- Podolnikova, N. P., Kushchayeva, Y. S., Wu, Y., Faust, J., Ugarova, T. P. The Role of Integrins α M β 2 (Mac-1, CD11b/CD18) and α D β 2 (CD11d/CD18) in Macrophage Fusion. Am J Pathol. 186 (8), 2105-2116 (2016).
- Faust, J. J., Christenson, W., Doudrick, K., Ros, R., Ugarova, T. P. Development of fusogenic glass surfaces that impart spatiotemporal control over macrophage fusion: Direct visualization of multinucleated giant cell formation. Biomaterials. 128, 160-171 (2017).
- Jenney, C. R., Anderson, J. M. Alkylsilane-modified surfaces: Inhibition of human macrophage adhesion and foreign body giant cell formation. J Biomed Mater Res. 46 (1), 11-21 (1999).
- Vignery, A. Methods to fuse macrophages in vitro. Cell Fusion: Overviews Methods. , 383-395 (2008).
- Zhao, Q., et al. Foreign-body giant cells and polyurethane biostability: In vivo correlation of cell adhesion and surface cracking. J Biomed Mater Res. 25 (2), 177-183 (1991).
- Anderson, J. M., Rodriguez, A., Chang, D. T. Foreign body reaction to biomaterials. Semin Immunol. 20 (2), 86-100 (2008).
- Jenney, C. R., Anderson, J. M. Effects of surface-coupled polyethylene oxide on human macrophage adhesion and foreign body giant cell formation in vitro. J Biomed Mater Res. 44 (2), 206-216 (1999).
- DeFife, K. M., Colton, E., Nakayama, Y., Matsuda, T., Anderson, J. M. Spatial regulation and surface chemistry control of monocyte/macrophage adhesion and foreign body giant cell formation by photochemically micropatterned surfaces. J Biomed Mater Res. 45 (2), 148-154 (1999).
- Jenney, C. R., DeFife, K. M., Colton, E., Anderson, J. M. Human monocyte/macrophage adhesion, macrophage motility, and IL-4-induced foreign body giant cell formation on silane-modified surfaces in vitro. J Biomed Mater Res. 41 (2), 171-184 (1998).
- Hell, S. W., Wichmann, J. Breaking the diffraction resolution limit by stimulated emission: stimulated-emission-depletion fluorescence microscopy. Opt Lett. 19 (11), 780-782 (1994).
- van de Linde, S., et al. Direct stochastic optical reconstruction microscopy with standard fluorescent probes. Nat Protocols. 6 (7), 991-1009 (2011).
- Fölling, J., et al. Fluorescence nanoscopy by ground-state depletion and single-molecule return. Nat Methods. 5 (11), 943-945 (2008).
- Heilemann, M., et al. Subdiffraction-resolution fluorescence imaging with conventional fluorescent probes. Ange Chem Int Edit. 47 (33), 6172-6176 (2008).
- Betzig, E. Proposed method for molecular optical imaging. Optics Letters. 20 (3), 237-239 (1995).
- Betzig, E., et al. Imaging intracellular fluorescent proteins at nanometer resolution. Science. 313 (5793), 1642-1645 (2006).
- Shtengel, G., et al. Interferometric fluorescent super-resolution microscopy resolves 3D cellular ultrastructure. P Natl Acad Sci U S A. 106 (9), 3125-3130 (2009).
- Shtengel, G., et al. Imaging cellular ultrastructure by PALM, iPALM, and correlative iPALM-EM. Method Cell Biol. 123, 273-294 (2013).
- Chen, B. C., et al. Lattice light-sheet microscopy: Imaging molecules to embryos at high spatiotemporal resolution. Science. 346 (6208), 1257998 (2014).
- Planchon, T. A., et al. Rapid three-dimensional isotropic imaging of living cells using Bessel beam plane illumination. Nat Methods. 8 (5), 417-423 (2011).
