قياس متزامنة من بيروكسيد الهيدروجين فائق أكسيد/وإنتاج NADH Dehydrogenases المتقدرية المحتوية على فلافين
Summary
تحتوي الميتوكوندريا على إنزيمات فلافين-تعتمد على عدة يمكن أن تنتج الأنواع الأكسجين التفاعلية (روس). رصد روس الإصدار من المواقع الفردية في الميتوكوندريا صعبة بسبب التفاعلات الجانبية غير المرغوب فيها. نقدم طريقة سهلة وغير مكلفة للتقييم المباشر لأسعار الأصلي للإفراج عن روس باستخدام فلافونزيميس المنقي والميكروسكوبيه فلوروميتري.
Abstract
وأفيد أن الميتوكوندريا يمكن أن تحتوي على مصادر الانزيمية يصل إلى 12 للأنواع الأكسجين التفاعلية (روس). وتشمل أغلبية هذه المواقع مجمعات فلافين-تعتمد على الجهاز التنفسي و dehydrogenases التي تنتج خليط أكسيد فائق (س2●-) وفوق أكسيد الهيدروجين (H2O2). دقيقة التحديد الكمي لإمكانات إنتاج روس من المواقع الفردية في الميتوكوندريا المعزولة يمكن أن تكون صعبة بسبب وجود أنظمة الدفاع المضادة للأكسدة وردود الفعل الجانبية التي تشكل أيضاس2●-/H2س2. يمكن أن تمس استعمال مثبطات غير محدد يمكن أن تعطل الاستقلاب المتقدرية أيضا قياسات بتغيير الإصدار روس من مواقع أخرى للإنتاج. نقدم هنا، طريقة سهلة لقياس إنتاج نيكوتيناميد الأدنين dinucleotide (NADH) وحاء2يا2 الإفراج المتزامن المنقي dehydrogenases فلافين مرتبطة. لأغراضنا هنا، استخدمنا بيروفات المنقي نازعة مجمع (بدك) و α-كيتوجلوتاراتي نازعة معقدة (كجدهك) من أصل قلب الخنزير كأمثلة. يسمح هذا الأسلوب لمقياس دقيق الأصلية ح2س2 الإفراج عن معدلات من خلال المواقع الفردية للإنتاج عن طريق القضاء على المصادر المحتملة الأخرى لنظم روس ومضادات الأكسدة. وبالإضافة إلى ذلك، هذا الأسلوب يسمح بإجراء مقارنة مباشرة للعلاقة بين حاء2يا2 الإفراج ونشاط إنزيم وفحص فعالية والانتقائية لمثبطات لإنتاج روس. عموما، يمكن أن يسمح هذا النهج للتقييم المتعمق لمعدلات الأصلي للإفراج عن روس للإنزيمات الفردية قبل إجراء تجارب أكثر تطورا مع الميتوكوندريا المعزولة أو الألياف العضلية بيرميبيليزيد.
Introduction
أن الهدف النهائي الأيض المغذيات جعل الادينوسين ثلاثي الفوسفات (ATP). في خلايا الثدييات، وهذا يحدث في الميتوكوندريا، العضيات مزدوجة-ميمبرانيد أن تحويل الطاقة المخزنة في الكربون إلى ATP. ويبدأ إنتاج ATP عندما الكربون كومبوستيد من الميتوكوندريا تشكيل حاملتي الإلكترون NADH وفلافين الأدنين dinucleotide (القوات المسلحة الهايتية2)1. NADH والقوات المسلحة الهايتية2 ثم تتأكسد بالمجمعات الرئوي وحدة فرعية متعددة الأول والثاني، على التوالي، ويجري نقل الإلكترونات المحررة إلى محطة طرفية إلكترون يقبلون الجزيئية الأكسجين (O2) في مجمع الرابع1. [ثرمودنميكلي] مواتي “انحدار” نقل الإلكترونات إلى س2 في نهاية السلسلة يقترن بتصدير البروتونات في إينتيرميمبراني الفضاء بمجمعات الأول والثالث والرابع. يؤدي هذا إلى إنشاء تدرج الكهروكيميائية transmembrane البروتونات (بروتون–دافع القوة)، نموذج مؤقتة من طاقة جيبس الحرة التي يتم استغلالها من قبل الخامس المعقدة جعل ATP2. تفاعلات نقل الإلكترونات في الميتوكوندريا لا تقترن تماما لإنتاج ATP. في نقاط مختلفة في دورة كريبس وسلسلة التنفس، قبل الأوان يمكن أن تتفاعل الإلكترونات مع س2 على شكل روس3. روس الأكثر بيولوجيا ذات الصلة التي تم إنشاؤها بواسطة الميتوكوندريا هي س2●- وح2س2. على الرغم من أن س2●- كثيرا ما يعتبر روس الدانية التي شكلتها الميتوكوندريا، من الواضح الآن أن مواقع الإنتاج تشكل مزيجاً من س2●- وح2س2، الذي يرتبط مع الحر المجموعات الراديكالية كيمياء فلافين الاصطناعية4،5. في المستويات العليا، روس يمكن أن تكون خطيرة، إتلاف المكونات البيولوجية اللازمة لوظيفة الخلية الناتجة في الشدة الأكسدة6. ومع ذلك، تفي بروس المتقدرية عند كميات منخفضة، الوظائف إرسال الإشارات الحيوية. على سبيل المثال، قد تورط حاء2يا2 الإفراج من الميتوكوندريا في السيطرة على تنشيط خلايا تي، إشارات الإجهاد (مثلاً، تنظيم دورات تعريفية لمسارات إشارات Nrf2)، تحريض من تكاثر الخلايا وتمايزها، إشارات الأنسولين والإصدار، وتغذية السلوك7. أحرز تقدم كبير في فهم إشارات مهمة روس. ومع ذلك، هامة لا تزال هناك أسئلة فيما يتعلق بالذي الإنزيمات في الميتوكوندريا بمثابة أهم المصادر وكيفية التحكم في الإنتاج.
الإصدار روس بموقع الإنتاج يعتمد على عدة عوامل: 1) تركز التبرع بالكترون للموقع، 2) حالة الأكسدة الموقع التبرع الإلكترون، 3) الوصول إلى الأكسجين، وتركيز 4) ونوع أكسدة الركازة3، 8 , 9-في الميتوكوندريا، عوامل أخرى مثل تركيز القوة المحتملة NADH والغشاء أيضا التأثير روس إنتاج8،10. على سبيل المثال، يزيد معدل س2●-/H2س2 إنتاج المنقي بدك أو كجدهك مع تزايد NADH توافر5،11. في هذا السيناريو، تتدفق الإلكترونات إلى الوراء من NADH إلى مركز المؤسسة في وحدة فرعية3 ه بدك أو كجدهك، الموقع لس2●-/H2س2 إنتاج12. وبالمثل، قد توفير نادٍ+ تأثير معاكس، تتناقص روس الإصدار من كجدهك12. وهكذا، يمكن أن يغير المسيطر من الدخول أو الخروج من الإلكترونات من مواقع الإنتاج روس تتشكلكم س2●-/H2س2 . على سبيل المثال، حظر فرعية2 ه من بدك أو كجدهك مع مؤشر أسعار المستهلك-613، حمض ليبويك تناظرية، ينتج تقريبا 90% انخفاض في س2●-/H2س2 إنتاج13. يمكن الحصول على نتائج مماثلة مع المواد الكيميائية S-جلوتاثيونيليشن المواد الحفازة ودياميدي وديسولفيرام، التي تلغي تقريبا س2●/H2س2 إنتاج بدك أو كجدهك عن طريق تصريف الجلوتاثيون ه 2 وحدة فرعية14. المفاضلة لعرقلة تدفق الإلكترون عن طريق فرعية2 ه بدك وكجدهك هو انخفاض في إنتاج NADH مما يقلل تكوين روس بسلسلة نقل الإلكترون (مثلاً، ثالثا المعقدة). هذا أيضا تقليل إنتاج ATP بسلسلة نقل الإلكترون. عموما، يمكن حظر دخول إلكترون إلى مواقع الإنتاج روس وسيلة فعالة للغاية لمراقبة س2●/H2يا2 الإنتاج.
يمكن أن تحتوي الميتوكوندرياتصل إلى 12 المحتملة س2●-/H2س2 مصادر6. معظم هذه المواقع المحتوية على فلافين الإنزيمات التي تولد مزيجاً من س2●- وح2س2. وقد يسمح باستخدام الركيزة مختلفة وتركيبات المانع لتحديد منها مجمعات الجهاز التنفسي و dehydrogenases المتقدرية بمثابةعالية السعة س2●-/H2س2 تشكيل مواقع في 3من أنسجة مختلفة. قد ثبت بمثابة عالية السعةس2●-/H2س2 المواقع التي ينبعث منها قدر في العضلات والكبد الميتوكوندريا13،15بدك وكجدهك. ومع ذلك، تبقى بعض الصعوبات فيما يتعلق بالنظر في س2●-/H2س2 تشكيل المحتملة من المواقع الفردية في الميتوكوندريا، والأثر أن الركازة مختلفة وتركيبات مثبط على أنشطة الإنزيمات. هذا هو سبب وجود تفاعلات جانبية غير مرغوب فيها (مثلاً، تشكيلس2●-/H2س2 بالمواقع عدا الإنزيم للفائدة)، تلويث المواد الغذائية المحلية (مثلاً،الدهنية الأحماض) أو العضيات (مثل، بيروكسيسوميس التي تشكل أيضاس2●-/H2س2)، واستخدام الموانع التي تفتقر إلى الانتقائية، و/أو استخدام المركبات التي تحول دون إنتاج روس ليس كاملا. يمكن أيضا تغيير بعض مثبطات الاستقلاب mitochondrial واتجاه تدفق الإلكترونات، وهذا يغير الإصدار روس من مواقع أخرى للإنتاج ويفند النتائج. معدلات المطلقة س2●-/H2يا2 الإفراج عن المواقع الفردية في الميتوكوندريا أيضا يصعب قياسها كمياً بسبب ارتفاع تركيز O2●- وح2س2 القضاء على الإنزيمات في الفضاء intermembrane ومصفوفة. ولذلك، يمكن القضاء على أي ردود الفعل المتضاربة التي يمكن أن تتداخل مع2س●-/H2يا2 الإفراج عن قياسات مفيدة عند تحديد سعة عالية س2●-/H2س2 تشكيل مواقع.
نقدم هنا، أسلوب بسيط يسمح للنظر المتزامن في س2●/H2س2 إنتاج وتكوين NADH بتنقية فلافين-تعتمد على ديهيدروجيناسيس. باستخدام الإنزيمات النقية، روس تشكيل ردود الفعل الجانبية غير المرغوب فيها وروس اللاإنسانية الإنزيمات يمكن القضاء على السماح لتدبير أكثر دقة من الأم س2●-/H2س2 معدلات الإنتاج للفرد فلافونزيميس. يمكن استخدام هذا الأسلوب لمقارنة مباشرة س2●-/H2س2 تشكيل قدرة dehydrogenases المنقي مختلفة أو مثبطات الشاشة الخاصة بالموقع المحتمل س2●-/H2س الإصدار 2 . وأخيراً، قياسس2●-/H2يا2 والإنتاج NADH في وقت واحد يمكن أن تسمح لإجراء تقييم في الوقت الحقيقي للعلاقة بين نشاط الإنزيم وروس الإفراج عن القدرات.
Protocol
Representative Results
Discussion
هذا البروتوكول مفيد منذ، 1) فإنه يلغي أي ردود الفعل المتضاربة التي قد تتداخل مع الكشف عن ح2س2 (مثلاً، والنظم المضادة للأكسدة أو مصادر أخرى لروس)، وإلا 2) يقدم تقييما مباشرا لمعدل أصلي إطلاق سراح روس من نازعة المتقدرية المحتوية على فلافين، مع 3) يسمح المقارنة بين الأم روس الإفر…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
تم تمويل هذا العمل من العلوم الطبيعية والهندسة بحوث المجلس من كندا (مقدمة). إنتاج الفيديو أجريت بالتعاون مع مركز الابتكار في التدريس والتعلم (المعاملات) في “جامعة ميموريال في نيوفاوندلاند”.
Materials
| Pyruvate dehydrogenase complex | SIGMA | P7032-10UN | purified flavoenzyme |
| alpha-ketoglutarate dehydrogenase complex | SIGMA | K1502-20UN | purified flavoenzyme |
| 30% hydrogen peroxide solution | SIGMA | HX0640-5 | reagent, standard curves |
| NAD+ | SIGMA | N0632-1G | reagent, activity/ROS release assay |
| NADH | SIGMA | N4505-100MG | reagent, standard curves |
| pyruvate | SIGMA | P2256-5G | reagent, activity/ROS release assay |
| alpha-ketoglutarate | SIGMA | 75892-25G | reagent, activity/ROS release assay |
| CoASH | SIGMA | C3019-25MG | reagent, activity/ROS release assay |
| thiamine pyrophosphate | SIGMA | C8754-1G | reagent, activity/ROS release assay |
| mannitol | SIGMA | M4125-100G | buffer component |
| Hepes | SIGMA | H3375-25G | buffer component |
| sucrose | SIGMA | S7903-250G | buffer component |
| EGTA | SIGMA | E3889-10G | buffer component |
| KMV | SIGMA | 198978-5G | reagent, ROS release inhibitor |
| CPI-613 | Santa Cruz | sc-482709 | reagent, ROS release inhibitor |
| SOD | SIGMA | S9697-15KU | reagent, ROS release detection |
| horseradish peroxidase | SIGMA | P8375-1KU | reagent, ROS release detection |
| Amplex Ultra Red | Thermofisher | A36006 | reagent, ROS release detection |
| Biotech Synergy 2 microplate reader | BioTek Instruments | microplate reader for assays | |
| Gen5 software | BioTek Instruments | software, used for collection of raw RFU | |
| Graphpad Prism | Graphpad software | software, data analysis | |
| Microsoft EXCEL | Microsoft | software, data analysis |
References
- Mailloux, R. J. Teaching the fundamentals of electron transfer reactions in mitochondria and the production and detection of reactive oxygen species. Redox Biol. 4, 381-398 (2015).
- Nicholls, D. G. Forty years of Mitchell’s proton circuit: From little grey books to little grey cells. Biochim Biophys Acta. 1777 (7-8), 550-556 (2008).
- Brand, M. D. Mitochondrial generation of superoxide and hydrogen peroxide as the source of mitochondrial redox signaling. Free Radic Biol Med. 100, 14-31 (2016).
- Massey, V. Activation of molecular oxygen by flavins and flavoproteins. J Biol Chem. 269 (36), 22459-22462 (1994).
- Mailloux, R. J., Gardiner, D., O’Brien, M. 2-Oxoglutarate dehydrogenase is a more significant source of O2(.-)/H2O2 than pyruvate dehydrogenase in cardiac and liver tissue. Free Radic Biol Med. 97, 501-512 (2016).
- Sies, H., Berndt, C., Jones, D. P. Oxidative Stress. Annu Rev Biochem. 86, 715-748 (2017).
- Kuksal, N., Chalker, J., Mailloux, R. J. Review. Progress in understanding the molecular oxygen paradox – function of mitochondrial reactive oxygen species in cell signaling. Biol Chem. , (2017).
- Murphy, M. P. How mitochondria produce reactive oxygen species. Biochem J. 417 (1), 1-13 (2009).
- Wong, H. S., Dighe, P. A., Mezera, V., Monternier, P. A., Brand, M. D. Production of superoxide and hydrogen peroxide from specific mitochondrial sites under different bioenergetic conditions. J Biol Chem. , (2017).
- Harper, M. E., Green, K., Brand, M. D. The efficiency of cellular energy transduction and its implications for obesity. Annu Rev Nutr. 28, 13-33 (2008).
- Ambrus, A., et al. Formation of reactive oxygen species by human and bacterial pyruvate and 2-oxoglutarate dehydrogenase multienzyme complexes reconstituted from recombinant components. Free Radic Biol Med. 89, 642-650 (2015).
- Tretter, L., Adam-Vizi, V. Generation of reactive oxygen species in the reaction catalyzed by alpha-ketoglutarate dehydrogenase. J Neurosci. 24 (36), 7771-7778 (2004).
- Slade, L., et al. Examination of the superoxide/hydrogen peroxide forming and quenching potential of mouse liver mitochondria. Biochim Biophys Acta. 1861 (8), 1960-1969 (2017).
- O’Brien, M., Chalker, J., Slade, L., Gardiner, D., Mailloux, R. J. Protein S-glutathionylation alters superoxide/hydrogen peroxide emission from pyruvate dehydrogenase complex. Free Radic Biol Med. 106, 302-314 (2017).
- Quinlan, C. L., et al. The 2-oxoacid dehydrogenase complexes in mitochondria can produce superoxide/hydrogen peroxide at much higher rates than complex I. J Biol Chem. 289 (12), 8312-8325 (2014).
- Mailloux, R. J., Craig Ayre, D., Christian, S. L. Induction of mitochondrial reactive oxygen species production by GSH mediated S-glutathionylation of 2-oxoglutarate dehydrogenase. Redox Biol. 8, 285-297 (2016).
- Mailloux, R. J., Gardiner, D., O’Brien, M. 2-Oxoglutarate dehydrogenase is a more significant source of O2(.-)/H2O2 than pyruvate dehydrogenase in cardiac and liver tissue. Free Radic Biol Med. 97, 501-512 (2016).
- Ambrus, A., Adam-Vizi, V. Human dihydrolipoamide dehydrogenase (E3) deficiency: Novel insights into the structural basis and molecular pathomechanism. Neurochem Int. , (2017).
- Young, A., Gardiner, D., Brosnan, M. E., Brosnan, J. T., Mailloux, R. J. Physiological levels of formate activate mitochondrial superoxide/hydrogen peroxide release from mouse liver mitochondria. FEBS Lett. 591 (16), 2426-2438 (2017).
- Fisher-Wellman, K. H., et al. Mitochondrial glutathione depletion reveals a novel role for the pyruvate dehydrogenase complex as a key H2O2-emitting source under conditions of nutrient overload. Free Radic Biol Med. 65, 1201-1208 (2013).
- Kussmaul, L., Hirst, J. The mechanism of superoxide production by NADH:ubiquinone oxidoreductase (complex I) from bovine heart mitochondria. Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (20), 7607-7612 (2006).
- Huang, L. S., Borders, T. M., Shen, J. T., Wang, C. J., Berry, E. A. Crystallization of mitochondrial respiratory complex II from chicken heart: a membrane-protein complex diffracting to 2.0. A. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 61 (Pt 4), 380-387 (2005).
- Yeh, J. I., Chinte, U., Du, S. Structure of glycerol-3-phosphate dehydrogenase, an essential monotopic membrane enzyme involved in respiration and metabolism. Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (9), 3280-3285 (2008).
