Medição simultânea de peróxido de hidrogénio superóxido e produção de NADH por desidrogenases mitocondriais contendo Flavin
Summary
As mitocôndrias contêm várias enzimas dependentes de flavina que podem produzir espécies reativas de oxigênio (ROS). Liberação de sites individuais nas mitocôndrias monitoramento ROS é um desafio devido às reações colaterais indesejados. Apresentamos um método fácil e barato para avaliação direta do nativas taxas para liberação ROS usando flavoenzymes purificado e microplacas fluorometry.
Abstract
Tem sido relatado que a mitocôndria pode conter até 12 fontes enzimáticas de espécies reativas de oxigênio (ROS). A maioria desses sites incluem complexos respiratórios flavin-dependente e desidrogenases que produzem uma mistura de superóxido (O2● –) e peróxido de hidrogênio (H2O2). Pode ser um desafio devido à presença de sistemas de defesa antioxidante e reações colaterais que também formam O2●-/ h2O2quantificação exata do potencial produção de ROS de sites individuais em mitocôndrias isoladas. Uso de inibidores inespecíficos que podem interromper a bioenergética mitocondrial também pode comprometer as medições alterando ROS lançamento de outros sites de produção. Aqui, apresentamos um método fácil para a medição simultânea de dinucleótido de nicotinamida e adenina (NADH) produção e lançamento de H2O2 por desidrogenases purificadas flavin-lig. Para este efeito, utilizámos purificada piruvato desidrogenase complexo (PDHC) e α-cetoglutarato desidrogenase complexo (KGDHC) de origem suína coração como exemplos. Este método permite uma medida exata de taxas lançamento2 de2O de H de nativos por sites individuais de produção, eliminando outras fontes potenciais de sistemas ROS e antioxidante. Além disso, este método permite uma comparação direta da relação entre a versão de2 H2O e atividade enzimática e o rastreio da eficácia e seletividade de inibidores para a produção de ROS. Em geral, esta abordagem pode permitir a avaliação aprofundada das taxas nativas de introdução ROS em enzimas individuais antes de conduzir experiências mais sofisticadas com mitocôndrias isoladas ou permeabilized fibra muscular.
Introduction
O objetivo final do metabolismo de nutrientes é tornar trifosfato de adenosina (ATP). Em células de mamíferos, isso ocorre nas mitocôndrias, organelas double-membraned que convertem a energia armazenada em carbono em ATP. A produção de ATP começa quando o carbono é queimado pela mitocôndria formando duas transportadoras de elétrons, NADH e dinucleótido de flavina e adenina (DANIII2)1. NADH e DANIII2 são então oxidados por complexos respiratórios multi subunidade I e II, respectivamente, e os elétrons libertados são levados até o terminal do elétron aceitador oxigênio molecular (O2) no complexo IV1. A termodinamicamente favorável “ladeira abaixo” transferência de elétrons para O2 no final da cadeia é acoplada à exportação de prótons para o intermembrane espaço pelos complexos I, III e IV. Isso cria um gradiente eletroquímico transmembrana de prótons (força motriz protónica), uma forma temporária de energia livre de Gibbs que é aproveitada pelo complexo V tornar ATP2. Reações de transferência de elétrons nas mitocôndrias não são perfeitamente acopladas a produção de ATP. Em vários pontos do ciclo de Krebs e a cadeia respiratória, elétrons prematuramente podem interagir com O2 para formar ROS3. ROS mais biologicamente relevante gerado por mitocôndrias são O2● – e H2O2. Embora O2● – é muitas vezes considerado o ROS proximal formado por mitocôndrias, agora é evidente que sites de produção formam uma mistura de O2● – e H2O2, que é associado com o livre química radical de flavin prótese grupos4,5. Em níveis elevados, ROS pode ser perigoso, danificando componentes biológicos necessários para a função celular, resultando em angústia oxidativo6. No entanto, em quantidades reduzidas, ROS mitocondriais cumprir funções de sinalização vitais. Por exemplo, lançamento de H2O2 de mitocôndrias tem sido implicado no controle da ativação de células T, sinalização de stress (por exemplo, indução de vias de sinalização Nrf2), a indução da proliferação celular e diferenciação, sinalização da insulina e liberação e alimentação comportamento7. Progresso considerável tem sido feito na compreensão da função de sinalização de ROS. No entanto, importantes questões ainda permanecem em relação à qual enzimas nas mitocôndrias servem como as fontes mais importantes e como a produção é controlada.
Lançamento ROS por um site de produção depende de vários fatores: 1) a concentração da doação de elétrons do site, 2) o estado redox do site doar elétrons, 3) acesso ao oxigênio e 4) a concentração e tipo de substrato de oxidação3, 8 , 9. nas mitocôndrias, outros fatores como a concentração de NADH e membrana potencial força também influenciam a produção de ROS8,10. Por exemplo, a taxa de O2●-/ h2O2 produção purificada PDHC ou KGDHC aumenta com NADH crescente disponibilidade de5,11. Nesse cenário, os elétrons estão fluindo para trás do NADH ao centro FAD na subunidade3 E PDHC ou KGDHC, o site para O2●-/ h2O2 produção12. Da mesma forma, a prestação de NAD+ tem o efeito contrário, diminuindo a liberação ROS de KGDHC12. Assim, controlando a entrada e a saída de elétrons a partir de sites de produção de ROS pode alterar quanto2●/h2O2 é formado. Por exemplo, bloqueando a subunidade2 E PDHC ou KGDHC com CPI-613, um ácido lipoico analógico, o que resulta em uma quase 90% diminuição2●/h2O2 produção13. Resultados semelhantes podem ser obtidos com o químico S-glutathionylation catalisadores, diamido e dissulfiram, que quase abolir O2●-/ h2O2 produção pelo PDHC ou KGDHC através da conjugação de glutationa para o E 2 subunidade14. O trade-off para bloquear o fluxo de elétrons através da subunidade2 E PDHC e KGDHC é uma diminuição na produção de NADH, que diminui a formação de ROS por cadeia de transporte de elétrons (por exemplo, complexo III). Isto também pode diminuir a produção de ATP pela cadeia de transporte de elétrons. Em geral, bloqueando a entrada do elétron aos locais de produção de ROS pode ser um meio altamente eficaz de controlar O2●-/ h2O2 produção.
As mitocôndrias podem conter até 12 potencial O2●-/ h2O2 fontes6. A maioria destes sites são flavin-contendo enzimas que geram uma mistura de O2● – e H2O2. Utilização de substrato diferente e combinações do inibidor permitiram a identificação dos quais complexos respiratórios e desidrogenases mitocondriais servem como O de alta capacidade2●-/ h2O2 formando sites em diferentes tecidos3. PDHC e KGDHC foram mostrados para servir como alta capacidade2●/h2O2 sites emitindo no músculo e fígado mitocôndrias13,15. No entanto, algumas dificuldades permanecem no que se refere a análise do2●/h2O2 formando potenciais de sites individuais em mitocôndrias e o impacto que combinações de inibidor e substrato diferente em a atividade das enzimas. Isto é devido à presença de reações colaterais indesejáveis (por exemplo, formação de2●/h2O2 por sites que não sejam a enzima de interesse), contaminando nutrientes endógenos (por exemplo,graxos ácidos) ou organelas (por exemplo,, peroxissomos que também formam O2●-/ h2O2) e uso de inibidores que a falta de seletividade, e/ou uso de compostos que não inibir totalmente a produção de ROS. Certos inibidores podem também alterar a bioenergética mitocondrial e a direção do fluxo de elétrons, e isto altera a liberação ROS de outros sites de produção e confunde os resultados. Preços absolutos para O2●/h2O2 liberação de sites individuais nas mitocôndrias também são difíceis de quantificar devido à alta concentração de O2● – e H2O2 eliminando as enzimas no espaço matriz e intermembrane. Portanto, a eliminação de reações concorrentes que possam interferir com O2●-/ h2O2 lançamento medições pode ser útil quando identificando O de alta capacidade2●-/ h2O2 formando sites.
Aqui, apresentamos um método simples que permite a análise simultânea de O2●-/ h2O2 produção e formação de NADH por purificada desidrogenases dependentes de flavin. Usando enzimas purificadas, indesejados ROS formando reações colaterais e ROS enzimas degradantes podem ser eliminadas permitindo uma medida mais precisa do nativo O2●-/ h2O2 taxas de produção para flavoenzymes individual. Esse método pode ser usado para comparar diretamente os2●/h2O2 formando a capacidade de diferentes desidrogenases purificadas ou aos potenciais inibidores específicos do site de tela para O2●-/ h2O versão 2 . Finalmente, medir2●/h2O2 e a produção de NADH simultaneamente pode permitir uma avaliação em tempo real da relação entre a atividade enzimática e a capacidade de liberação ROS.
Protocol
Representative Results
Discussion
Este protocolo é vantajoso desde, 1) elimina quaisquer reacções concorrentes que caso contrário podem interferir com o H2O2 detecção (por exemplo, sistemas antioxidantes ou outras fontes de ROS), 2) fornece uma avaliação directa da taxa nativa de ROS de lançamento por uma desidrogenase mitocondrial contendo flavin, 3) permite a comparação do nativo ROS liberar a taxas de dois ou mais purificado desidrogenases flavin-baseado, 4) pode permitir a uma comparação direta da taxa de a…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho foi financiado pelas ciências naturais e engenharia pesquisa Conselho de Canadá (NSERC). Produção de vídeo foi realizada em colaboração com o centro de inovação no ensino e aprendizagem (DIOC) na Memorial University of Newfoundland.
Materials
| Pyruvate dehydrogenase complex | SIGMA | P7032-10UN | purified flavoenzyme |
| alpha-ketoglutarate dehydrogenase complex | SIGMA | K1502-20UN | purified flavoenzyme |
| 30% hydrogen peroxide solution | SIGMA | HX0640-5 | reagent, standard curves |
| NAD+ | SIGMA | N0632-1G | reagent, activity/ROS release assay |
| NADH | SIGMA | N4505-100MG | reagent, standard curves |
| pyruvate | SIGMA | P2256-5G | reagent, activity/ROS release assay |
| alpha-ketoglutarate | SIGMA | 75892-25G | reagent, activity/ROS release assay |
| CoASH | SIGMA | C3019-25MG | reagent, activity/ROS release assay |
| thiamine pyrophosphate | SIGMA | C8754-1G | reagent, activity/ROS release assay |
| mannitol | SIGMA | M4125-100G | buffer component |
| Hepes | SIGMA | H3375-25G | buffer component |
| sucrose | SIGMA | S7903-250G | buffer component |
| EGTA | SIGMA | E3889-10G | buffer component |
| KMV | SIGMA | 198978-5G | reagent, ROS release inhibitor |
| CPI-613 | Santa Cruz | sc-482709 | reagent, ROS release inhibitor |
| SOD | SIGMA | S9697-15KU | reagent, ROS release detection |
| horseradish peroxidase | SIGMA | P8375-1KU | reagent, ROS release detection |
| Amplex Ultra Red | Thermofisher | A36006 | reagent, ROS release detection |
| Biotech Synergy 2 microplate reader | BioTek Instruments | microplate reader for assays | |
| Gen5 software | BioTek Instruments | software, used for collection of raw RFU | |
| Graphpad Prism | Graphpad software | software, data analysis | |
| Microsoft EXCEL | Microsoft | software, data analysis |
References
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