Medida simultánea de superóxido de Hidrógeno peróxido y la producción de NADH deshidrogenasas mitocondriales Flavin-que contiene
Summary
Las mitocondrias contienen varias enzimas flavin dependientes que pueden producir especies reactivas del oxígeno (ROS). Monitoreo ROS liberación de sitios individuales en la mitocondria es difícil debido a reacciones secundarias no deseadas. Presentamos un método fácil y económico para la evaluación directa de tasas nativas para la liberación ROS con flavoenzymes purificada y microplacas fluorometría.
Abstract
Se ha reportado que las mitocondrias pueden contener hasta 12 fuentes enzimáticas de especies reactivas del oxígeno (ROS). La mayoría de estos sitios incluyen complejos respiratorios dependiente de flavin y Deshidrogenasas que producen una mezcla de superóxido (O2● –) y peróxido de hidrógeno (H2O2). Cuantificación precisa del potencial de producción de ROS de sitios individuales en mitocondrias aisladas puede ser difícil debido a la presencia de reacciones laterales que también forman O2●-/ h2O2y sistemas de defensa antioxidantes. Uso de inhibidores no específicos que pueden perturbar la bioenergética mitocondrial también puede comprometer medidas alterando la liberación ROS de otros sitios de producción. Aquí, presentamos un método sencillo para la medida simultánea de H2O2 liberación y producción de nicotinamida adenina dinucleótido (NADH) por Deshidrogenasas purificadas flavin-ligado. Para nuestros propósitos aquí, hemos utilizado el complejo de purificado de la piruvato deshidrogenasa (PDHC) y α-cetoglutarato deshidrogenasa complejo (KGDHC) de origen porcino corazón como ejemplos. Este método permite una medida exacta nativas H2O2 liberación de las tasas de sitios individuales de la producción mediante la eliminación de otras posibles fuentes de ROS y antioxidante. Además, este método permite una comparación directa de la relación entre la liberación de H2O2 y la actividad enzimática y la proyección de la eficacia y selectividad de los inhibidores para la producción de ROS. En general, este enfoque puede permitir la evaluación en profundidad de nativas tasas de liberación ROS para enzimas individuales antes de la realización de experimentos más sofisticados con mitocondrias aisladas o fibra muscular permeabilized.
Introduction
El objetivo final del metabolismo de nutrientes es hacer trifosfato de adenosina (ATP). En células de mamíferos, esto ocurre en las mitocondrias, orgánulos de doble membrana que convierten la energía almacenada en el carbón en ATP. La producción de ATP comienza cuando el carbón es quemado por las mitocondrias formando dos portadores de electrones, NADH y flavin-adenin-dinucleótido (FADH2)1. NADH y FADH2 es entonces oxidado por complejos respiratorios de multi-subunidades I y II, respectivamente, y los electrones liberados se transportaron para el oxígeno molecular (O2) de terminal del electrón aceptor en el complejo IV1. La termodinámicamente favorable “cuesta abajo” transferencia de electrones al O2 en el final de la cadena se acopla a la exportación de protones en la intermembrana del espacio por los complejos I, III y IV. Esto crea un gradiente electroquímico transmembrana de protones (fuerza protón-motriz), una forma temporal de la energía libre de Gibbs que es aprovechada por el complejo V para hacer ATP2. Reacciones de transferencia de electrones en las mitocondrias no están perfectamente acopladas a la producción de ATP. En varios puntos en el ciclo de Krebs y la cadena respiratoria, los electrones prematuramente pueden interactuar con O2 para formar ROS3. El ROS biológicamente más relevante generado por las mitocondrias son O2● – y H2O2. Aunque O2●- a menudo se considera el ROS proximal formado por mitocondrias, ahora es evidente que los sitios de producción forman una mezcla de O2● – y H2O2, que se asocia con el libre los grupos de química radical de flavin prótesis4,5. En niveles elevados, ROS puede ser peligroso, dañar a los componentes biológicos necesarios para la función de la célula dando como resultado sufrimiento oxidativo6. Sin embargo, en bajas cantidades, ROS mitocondriales cumplir funciones vitales de señalización. Por ejemplo, liberación H2O2 las mitocondrias se ha implicado en el control de la activación del T-cell, señalización de estrés (p. ej., inducción de vías de señalización Nrf2), la inducción de proliferación celular y diferenciación, señalización de la insulina y liberación, alimentación y comportamiento7. Considerables progresos en la comprensión de la función de señalización de ROS. Sin embargo, importantes preguntas permanecen con respecto a que las enzimas de las mitocondrias sirven como las fuentes más importantes y cómo se controla la producción.
Liberación ROS por un sitio de producción depende de varios factores: 1) la concentración de la donación de electrones del sitio, 2) el estado redox del sitio donando electrones, 3) acceso a oxígeno y 4) la concentración y tipo de sustrato de oxidación3, 8 , 9. en las mitocondrias, otros factores como la concentración de NADH y la membrana fuerza potencial también influyen ROS producción8,10. Por ejemplo, la tasa de O2●/h2O2 producción purificada PDHC o KGDHC aumenta con la creciente disponibilidad de NADH5,11. En este escenario, los electrones están fluyendo hacia atrás de NADH para el centro de la moda en la subunidad de3 E de la PDHC o KGDHC, el sitio de O2●-/ h2O2 producción12. Asimismo, la disposición de NAD+ tiene el efecto contrario, disminuyendo la liberación ROS de KGDHC12. Así, control entrada o salida de electrones de sitios de producción de ROS puede alterar la cantidad O2●-/ h2O2 está formado. Por ejemplo, el bloqueo de la subunidad de2 E de la PDHC o KGDHC con CPI-613, un ácido lipoico analógico, resultados en un casi 90% disminución O2●-/ h2O2 producción13. Resultados similares pueden obtenerse con la química S glutathionylation catalizadores, diamida y disulfiram, que casi abolir O2●/h2O2 producción PDHC o KGDHC a través de la conjugación del glutatión para el E 2 subunidad14. La compensación por bloqueo del flujo de electrones a través de la subunidad de2 E de la PDHC y KGDHC es una disminución en la producción de NADH que disminuye la formación de ROS por la cadena de transporte del electrón (e.g., complejo III). Esto también puede disminuir la producción de ATP por la cadena de transporte de electrones. En general, bloqueo de entrada de electrones a los sitios de producción de ROS puede ser un medio muy eficaz de controlar O2●/h2O2 producción.
Las mitocondrias pueden contener hasta 12 posibles O2●-/ h2O2 fuentes6. La mayoría de estos sitios son el flavin-que contiene las enzimas que generan una mezcla de O2● – y H2O2. Uso de combinaciones de inhibidor y sustrato diferentes han permitido la identificación de que complejos respiratorios y deshidrogenasas mitocondriales sirven dealta capacidad O2●-/ h2O2 formando sitios en diferentes tejidos3. PDHC y KGDHC han demostrado servir de alta capacidad O2●-/ h2O2 sitios emisores en músculo y hígado mitocondria13,15. Sin embargo, quedan algunas dificultades en relación con el examen de la O2●-/ h2O2 formando potenciales de sitios individuales en las mitocondrias y el impacto que tienen sustrato diferentes y combinaciones del inhibidor en las actividades de las enzimas. Esto es debido a la presencia de reacciones laterales no deseadas (por ejemplo, la formación de O2●-/ h2O2 por sitios con excepción de la enzima de interés), contaminante nutrientes endógenos (p. ej.,grasos ácidos) u organelos (e.g., peroxisomas que también forman O2●-/ h2O2) y uso de inhibidores que carecen de selectividad, o uso de compuestos que no inhibir totalmente la producción de ROS. Ciertos inhibidores también pueden alterar la bioenergética mitocondrial y la dirección del flujo de electrones, y esto altera la liberación ROS de otros sitios de la producción y confunde los resultados. Tasas absolutas para O2●/h2O2 liberación de sitios individuales en las mitocondrias también son difíciles de cuantificar debido a la alta concentración de O2● – y H2O2 la eliminación de enzimas en el espacio intermembrana matriz. Por lo tanto, eliminación de reacciones concurrentes que pueden interferir con O2●/h2O2 liberación mediciones puede ser útil identificar alta capacidad O2● –/H2O2 formación de sitios.
Aquí, presentamos un método simple que permite el examen simultáneo de O2●/h2O2 producción y formación de NADH deshidrogenasas dependientes de flavina purificadas. Mediante el uso de enzimas purificadas, no deseados ROS formando reacciones secundarias y ROS degradando enzimas pueden eliminarse permitiendo una medida más precisa de nativos O2●-/ h2O2 tasas de producción para flavoenzymes individual. Este método puede utilizarse para comparar directamente el O2●-/ h2O2 formando la capacidad de diferentes Deshidrogenasas purificadas o inhibidores específicos del sitio potencial de pantalla O2●-/ h2O liberación de 2 . Por último, medición O2●-/ h2O2 y producción de NADH al mismo tiempo permite una evaluación en tiempo real de la relación entre la actividad enzimática y la capacidad de liberación ROS.
Protocol
Representative Results
Discussion
Este protocolo es ventajosa desde, 1) que elimina cualquier competencia reacciones que de lo contrario pueden interferir con la detección de H2O2 (p. ej., sistemas antioxidantes u otras fuentes de ROS), 2) ofrece una evaluación directa de la tasa natural de ROS liberar por una deshidrogenasa mitocondrial de flavin-que contiene, 3) permite la comparación del nativo ROS liberar las tasas de dos o más purificaron basada en flavin Deshidrogenasas, 4) puede permitir una comparación directa …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo fue financiado por las ciencias naturales e Ingeniería investigación Consejo de Canadá (NSERC). Producción de video se llevó a cabo en colaboración con el centro para la innovación en la enseñanza y aprendizaje (CITL) en Universidad conmemorativa de Terranova.
Materials
| Pyruvate dehydrogenase complex | SIGMA | P7032-10UN | purified flavoenzyme |
| alpha-ketoglutarate dehydrogenase complex | SIGMA | K1502-20UN | purified flavoenzyme |
| 30% hydrogen peroxide solution | SIGMA | HX0640-5 | reagent, standard curves |
| NAD+ | SIGMA | N0632-1G | reagent, activity/ROS release assay |
| NADH | SIGMA | N4505-100MG | reagent, standard curves |
| pyruvate | SIGMA | P2256-5G | reagent, activity/ROS release assay |
| alpha-ketoglutarate | SIGMA | 75892-25G | reagent, activity/ROS release assay |
| CoASH | SIGMA | C3019-25MG | reagent, activity/ROS release assay |
| thiamine pyrophosphate | SIGMA | C8754-1G | reagent, activity/ROS release assay |
| mannitol | SIGMA | M4125-100G | buffer component |
| Hepes | SIGMA | H3375-25G | buffer component |
| sucrose | SIGMA | S7903-250G | buffer component |
| EGTA | SIGMA | E3889-10G | buffer component |
| KMV | SIGMA | 198978-5G | reagent, ROS release inhibitor |
| CPI-613 | Santa Cruz | sc-482709 | reagent, ROS release inhibitor |
| SOD | SIGMA | S9697-15KU | reagent, ROS release detection |
| horseradish peroxidase | SIGMA | P8375-1KU | reagent, ROS release detection |
| Amplex Ultra Red | Thermofisher | A36006 | reagent, ROS release detection |
| Biotech Synergy 2 microplate reader | BioTek Instruments | microplate reader for assays | |
| Gen5 software | BioTek Instruments | software, used for collection of raw RFU | |
| Graphpad Prism | Graphpad software | software, data analysis | |
| Microsoft EXCEL | Microsoft | software, data analysis |
References
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