Gelijktijdige meting van Superoxide/waterstofperoxide en NADH productie door Flavin-bevattende mitochondriale Dehydrogenases
Summary
Mitochondriën bevatten verschillende flavin-afhankelijke enzymen die van reactieve zuurstof soorten (ROS produceren kunnen). Controle van ROS is vrijlating uit afzonderlijke sites in mitochondriën uitdagend als gevolg van ongewenste kant reacties. We presenteren een gemakkelijke en goedkope methode voor directe beoordeling van inheemse tarieven voor ROS release met behulp van gezuiverde flavoenzymes en microplate fluorometry.
Abstract
Er werd gemeld dat de mitochondriën maximaal 12 enzymatische bronnen van reactieve zuurstof soorten (ROS) kunnen bevatten. Een meerderheid van deze sites zijn flavin-afhankelijke respiratoire complexen en dehydrogenases die een mengsel van superoxide (O2● –) en waterstof peroxide (H2O2) produceren. Nauwkeurige kwantificering van de ROS-producerende potentieel van afzonderlijke sites in geïsoleerde mitochondriën kunnen zijn uitdagend als gevolg van de aanwezigheid van antioxidant defense-systemen en reacties van de kant die ook O2● –/H2O2 vormen. Gebruik van niet-specifieke remmers die mitochondriale Bioenergetica verstoren kan kunt ook metingen compromis door een wijziging van de ROS release van andere sites van de productie. Hier presenteren we een eenvoudige methode voor de gelijktijdige meting van H2O2 release en nicotinamide adenine dinucleotide (NADH) productie door gezuiverde flavin alternerende dehydrogenases. Wij hebben voor onze doeleinden hier, gezuiverde pyruvaat dehydrogenase complex (PDHC) en α-ketoglutarate dehydrogenase complex (KGDHC) van oorsprong van de varkens hart gebruikt als voorbeelden. Deze methode zorgt voor een nauwkeurige maatstaf van inheemse H2O2 release tarieven door afzonderlijke sites van de productie door het elimineren van andere potentiële bronnen van ROS en antioxidant systemen. Bovendien, zorgt deze methode voor een directe vergelijking van de relatie tussen de H2O2 release en de enzymactiviteit en de screening van de doeltreffendheid en de selectiviteit van remmers voor de productie van ROS. Over het geheel genomen is deze aanpak kan zorgen voor de grondige evaluatie van inheemse tarieven van ROS release voor afzonderlijke enzymen voorafgaand aan meer geavanceerde experimenten met geïsoleerde mitochondriën of spiervezel permeabel.
Introduction
Het uiteindelijke doel van nutriënten metabolisme is dat adenosinetrifosfaat (ATP). In de cellen van zoogdieren, dit gebeurt in de mitochondriën, dubbel-membraned organellen die de energie opgeslagen in koolstof in ATP omzetten. De productie van ATP begint wanneer koolstof is verbrand door de mitochondriën vormen twee elektron luchtvaartmaatschappijen, NADH en flavine adenine dinucleotide (FADH2)1. NADH en FADH2 worden vervolgens geoxideerd door multi subeenheid respiratoire complexen I en II, respectievelijk, en de bevrijde elektronen zijn overgezet naar de terminal elektron acceptor moleculaire zuurstof (O2) bij complexe IV1. De thermodynamisch gunstige “afdaling” overdracht van elektronen aan O2 aan het einde van de keten is gekoppeld aan de export van protonen in de intermembrane ruimte door complexen I, III en IV. Hierdoor ontstaat een transmembraan elektrochemische gradiënt van protonen (proton-motor), een tijdelijke vorm van Gibbs vrije energie die wordt onttrokken door complexe V om ATP2te brengen. Electron transfer reacties in mitochondriën zijn niet perfect gekoppeld aan de ATP productie. Op verschillende punten in de citroenzuurcyclus en de luchtwegen keten, kunnen elektronen voortijdig communiceren met O2 aan formulier ROS3. Het meest biologisch relevante ROS gegenereerd door mitochondriën zijn O2●- en H2O2. Hoewel O2● – wordt vaak beschouwd als de proximale ROS gevormd door mitochondriën, is het nu duidelijk dat sites van productie een mengsel van O2●- en H2O2 vormen, die is gekoppeld aan het vrije verkeer radicale chemie van flavin prothetische groepen4,5. Op een hoog niveau kunnen ROS gevaarlijke, schadelijke biologische bestanddelen die nodig zijn voor cel functie wat resulteert in oxidatieve nood6. Echter bij lage bedragen vervullen mitochondriale ROS signalering lichaamsfuncties. Bijvoorbeeld heeft H2O2 vrijlating uit de mitochondriën betrokken bij de controle van T-cel activatie, stress signalering (b.v., inductie van Nrf2 signaalroutes), de inductie van celproliferatie en differentiatie, insuline signalering en versie en voeding gedrag7. Aanzienlijke vooruitgang is geboekt in het begrip van de signalering functie van ROS. Echter belangrijke vragen blijven met betrekking tot die enzymen in mitochondriën dienen als de belangrijkste bronnen en hoe de productie wordt gecontroleerd.
ROS vrijlating door een plaats van productie is afhankelijk van verschillende factoren: 1) de concentratie van het doneren van de elektron site, 2) de redox staat van de elektron doneren site, 3) toegang tot zuurstof, en 4) de concentratie en het type van oxidatie substraat,3, 8 , 9. in de mitochondriën, andere factoren zoals ook invloed op de concentratie van NADH en membraan potentiële kracht ROS productie8,10. Bijvoorbeeld, het tarief van O2● –/H2O2 productie door gezuiverde PDHC of KGDHC neemt toe met toenemende NADH beschikbaarheid-5,11. In dit scenario stromen elektronen achteruit van NADH naar het midden van de FAD in de E-3 subeenheid van PDHC of KGDHC, de site voorO2● –/H2O2 productie12. Ook heeft de levering van NAD+ het tegenovergestelde effect, afnemende ROS vrijlating uit KGDHC12. Zo kunt controlerende binnenkomen of verlaten van elektronen van sites van ROS productie wijzigenhoeveel O2● –/H2O2 wordt gevormd. Bijvoorbeeld, het blokkeren van de E-2 subeenheid van PDHC of KGDHC met de CPI-613, een analoge, resulteert in een bijna 90% afname van O2● –/H2O2 productie13liponzuur. Vergelijkbare resultaten kunnen worden verkregen met de chemische S-glutathionylation katalysatoren, diamide en disulfiram, die bijna af te O2● –/H2O2 productie door PDHC of KGDHC via de vervoeging van glutathion tot en met de E schaffen 2 subeenheid14. De trade-off voor het blokkeren van de elektronen stromen door de E-2 subeenheid van PDHC en KGDHC is een afname van de productie van NADH die ROS vorming door het elektronentransport keten (bijvoorbeeldcomplexe III vermindert). Dit kan door de keten elektronentransport ATP-uitvoer vertragen. Blokkeren van elektron toegang tot sites van ROS productie kunnen over het algemeen een zeer effectief middel O2● –/H2O2 productie te controleren.
Mitochondriën kunnen maximaal 12 potentiële O2● –/H2O2 bronnen6bevatten. De meeste van deze sites zijn flavin bevatten enzymen die het genereren van een mengsel van O2●- en H2O2. Gebruik verschillende substraat of remmer combinaties zijn toegestaan voor de identificatie die respiratoire complexen en mitochondriale dehydrogenases dienen alshoge capaciteit O2● –/H2O2 vorming vestigingen in verschillende weefsels en3. PDHC en KGDHC is gebleken om te dienen als hoge capaciteit O2● –/H2O2 emitterende sites in spieren en lever mitochondriën13,15. Bepaalde problemen blijven echter met betrekking tot het onderzoek van de O2● –/H2O2 vormen van afzonderlijke sites in mitochondriën en de invloed die verschillende substraat en remmer combinaties hebben op potentiële de activiteiten van de enzymen. Dit is te wijten aan de aanwezigheid van ongewenste kant Reacties (bijvoorbeeld, vorming vanO2● –/H2O2 door sites dan het enzym van belang), besmetten endogene voedingsstoffen (bvvetzuren zuren) of organellen (b.v., peroxisomen die ook O2● –/H2O2 vormen), en gebruik van Remmers, dat het gebrek aan selectiviteit, en/of gebruik van stoffen die doen niet volledig ROS productie remmen. Bepaalde remmers kunnen ook veranderen de mitochondriale Bioenergetica en de richting van de stroom van elektronen, en dit verandert ROS release van andere sites van productie en kunstdiscours resultaten. Absolute tarieven voor O2● –/H2O2 release van afzonderlijke sites in mitochondriën zijn ook moeilijk te kwantificeren vanwege de hoge concentratie van O2●- en H2O2 de afschaffing van enzymen in de matrix en intermembrane ruimte. Eliminatie van eventuele concurrerende reacties die met O2● –/H2O2 release metingen interfereren kunnen kan dus nuttig bij het bepalen van dehoge capaciteit O2● –/H2O2 vormen van sites.
Hier presenteren we een eenvoudige methode die voor de gelijktijdige behandeling van O2● –/H2O2 productie en NADH vorming door gezuiverde flavin-afhankelijke dehydrogenases zorgt. Met behulp van gezuiverde enzymen, kunnen ongewenste ROS vormen kant reacties en ROS vernederende enzymen worden geëlimineerd zodat voor een meer nauwkeurige maatstaf van inheemse O2● –/H2O2 productie tarieven voor individuele flavoenzymes. Deze methode kan worden gebruikt om rechtstreeks vergelijken de O2● –/H2O2 vormen van de capaciteit van verschillende gezuiverde dehydrogenases of scherm potentiële site-specific remmers voor O2● –/H2O 2 release. Ten slotte kan meten O2● –/H2O2 en NADH productie gelijktijdig zorgen voor een real-time beoordeling van de relatie tussen de enzymactiviteit en ROS release capaciteit.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dit protocol is gunstig sinds, 1) het elimineert eventuele concurrerende reacties die anders H2O2 detectie (b.v., antioxidant systemen of andere bronnen van ROS), 2 storen) biedt een directe beoordeling van het eigen tempo van de ROS vrijgeven door een flavin-bevattende mitochondriale dehydrogenase, 3) maakt de vergelijking voor de native ROS vrijgeven tarieven van twee of meer gezuiverd flavin gebaseerde dehydrogenases, 4) kunnen zorgen voor een directe vergelijking van de snelheid van ROS…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd gefinancierd door de Natural Sciences and Engineering Research Raad van Canada (NSERC). Video productie werd uitgevoerd in samenwerking met het centrum voor innovatie in het onderwijs en leren (CITL) op de Memorial University van Newfoundland.
Materials
| Pyruvate dehydrogenase complex | SIGMA | P7032-10UN | purified flavoenzyme |
| alpha-ketoglutarate dehydrogenase complex | SIGMA | K1502-20UN | purified flavoenzyme |
| 30% hydrogen peroxide solution | SIGMA | HX0640-5 | reagent, standard curves |
| NAD+ | SIGMA | N0632-1G | reagent, activity/ROS release assay |
| NADH | SIGMA | N4505-100MG | reagent, standard curves |
| pyruvate | SIGMA | P2256-5G | reagent, activity/ROS release assay |
| alpha-ketoglutarate | SIGMA | 75892-25G | reagent, activity/ROS release assay |
| CoASH | SIGMA | C3019-25MG | reagent, activity/ROS release assay |
| thiamine pyrophosphate | SIGMA | C8754-1G | reagent, activity/ROS release assay |
| mannitol | SIGMA | M4125-100G | buffer component |
| Hepes | SIGMA | H3375-25G | buffer component |
| sucrose | SIGMA | S7903-250G | buffer component |
| EGTA | SIGMA | E3889-10G | buffer component |
| KMV | SIGMA | 198978-5G | reagent, ROS release inhibitor |
| CPI-613 | Santa Cruz | sc-482709 | reagent, ROS release inhibitor |
| SOD | SIGMA | S9697-15KU | reagent, ROS release detection |
| horseradish peroxidase | SIGMA | P8375-1KU | reagent, ROS release detection |
| Amplex Ultra Red | Thermofisher | A36006 | reagent, ROS release detection |
| Biotech Synergy 2 microplate reader | BioTek Instruments | microplate reader for assays | |
| Gen5 software | BioTek Instruments | software, used for collection of raw RFU | |
| Graphpad Prism | Graphpad software | software, data analysis | |
| Microsoft EXCEL | Microsoft | software, data analysis |
References
- Mailloux, R. J. Teaching the fundamentals of electron transfer reactions in mitochondria and the production and detection of reactive oxygen species. Redox Biol. 4, 381-398 (2015).
- Nicholls, D. G. Forty years of Mitchell’s proton circuit: From little grey books to little grey cells. Biochim Biophys Acta. 1777 (7-8), 550-556 (2008).
- Brand, M. D. Mitochondrial generation of superoxide and hydrogen peroxide as the source of mitochondrial redox signaling. Free Radic Biol Med. 100, 14-31 (2016).
- Massey, V. Activation of molecular oxygen by flavins and flavoproteins. J Biol Chem. 269 (36), 22459-22462 (1994).
- Mailloux, R. J., Gardiner, D., O’Brien, M. 2-Oxoglutarate dehydrogenase is a more significant source of O2(.-)/H2O2 than pyruvate dehydrogenase in cardiac and liver tissue. Free Radic Biol Med. 97, 501-512 (2016).
- Sies, H., Berndt, C., Jones, D. P. Oxidative Stress. Annu Rev Biochem. 86, 715-748 (2017).
- Kuksal, N., Chalker, J., Mailloux, R. J. Review. Progress in understanding the molecular oxygen paradox – function of mitochondrial reactive oxygen species in cell signaling. Biol Chem. , (2017).
- Murphy, M. P. How mitochondria produce reactive oxygen species. Biochem J. 417 (1), 1-13 (2009).
- Wong, H. S., Dighe, P. A., Mezera, V., Monternier, P. A., Brand, M. D. Production of superoxide and hydrogen peroxide from specific mitochondrial sites under different bioenergetic conditions. J Biol Chem. , (2017).
- Harper, M. E., Green, K., Brand, M. D. The efficiency of cellular energy transduction and its implications for obesity. Annu Rev Nutr. 28, 13-33 (2008).
- Ambrus, A., et al. Formation of reactive oxygen species by human and bacterial pyruvate and 2-oxoglutarate dehydrogenase multienzyme complexes reconstituted from recombinant components. Free Radic Biol Med. 89, 642-650 (2015).
- Tretter, L., Adam-Vizi, V. Generation of reactive oxygen species in the reaction catalyzed by alpha-ketoglutarate dehydrogenase. J Neurosci. 24 (36), 7771-7778 (2004).
- Slade, L., et al. Examination of the superoxide/hydrogen peroxide forming and quenching potential of mouse liver mitochondria. Biochim Biophys Acta. 1861 (8), 1960-1969 (2017).
- O’Brien, M., Chalker, J., Slade, L., Gardiner, D., Mailloux, R. J. Protein S-glutathionylation alters superoxide/hydrogen peroxide emission from pyruvate dehydrogenase complex. Free Radic Biol Med. 106, 302-314 (2017).
- Quinlan, C. L., et al. The 2-oxoacid dehydrogenase complexes in mitochondria can produce superoxide/hydrogen peroxide at much higher rates than complex I. J Biol Chem. 289 (12), 8312-8325 (2014).
- Mailloux, R. J., Craig Ayre, D., Christian, S. L. Induction of mitochondrial reactive oxygen species production by GSH mediated S-glutathionylation of 2-oxoglutarate dehydrogenase. Redox Biol. 8, 285-297 (2016).
- Mailloux, R. J., Gardiner, D., O’Brien, M. 2-Oxoglutarate dehydrogenase is a more significant source of O2(.-)/H2O2 than pyruvate dehydrogenase in cardiac and liver tissue. Free Radic Biol Med. 97, 501-512 (2016).
- Ambrus, A., Adam-Vizi, V. Human dihydrolipoamide dehydrogenase (E3) deficiency: Novel insights into the structural basis and molecular pathomechanism. Neurochem Int. , (2017).
- Young, A., Gardiner, D., Brosnan, M. E., Brosnan, J. T., Mailloux, R. J. Physiological levels of formate activate mitochondrial superoxide/hydrogen peroxide release from mouse liver mitochondria. FEBS Lett. 591 (16), 2426-2438 (2017).
- Fisher-Wellman, K. H., et al. Mitochondrial glutathione depletion reveals a novel role for the pyruvate dehydrogenase complex as a key H2O2-emitting source under conditions of nutrient overload. Free Radic Biol Med. 65, 1201-1208 (2013).
- Kussmaul, L., Hirst, J. The mechanism of superoxide production by NADH:ubiquinone oxidoreductase (complex I) from bovine heart mitochondria. Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (20), 7607-7612 (2006).
- Huang, L. S., Borders, T. M., Shen, J. T., Wang, C. J., Berry, E. A. Crystallization of mitochondrial respiratory complex II from chicken heart: a membrane-protein complex diffracting to 2.0. A. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 61 (Pt 4), 380-387 (2005).
- Yeh, J. I., Chinte, U., Du, S. Structure of glycerol-3-phosphate dehydrogenase, an essential monotopic membrane enzyme involved in respiration and metabolism. Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (9), 3280-3285 (2008).
