Süperoksit/hidrojen peroksit ve NADH üretim mitokondriyal Dehydrogenases Flavin içeren tarafından eş zamanlı ölçüm
Summary
Mitokondri Reaktif oksijen türleri (ROS) üretebilir birkaç flavin bağımlı enzim içerir. ROS izleme mitokondri içinde tek tek siteleri istenmeyen yan tepkiler nedeniyle zorlu sürümüdür. Biz saf flavoenzymes ve Mikroplaka fluorometry kullanarak ROS yayımı için yerel oranları doğrudan değerlendirilmesi için bir kolay, ucuz yöntemi mevcut.
Abstract
Mitokondri Reaktif oksijen türleri (ROS) 12 enzimatik kaynakları içerebilir bildirilmiştir. Bu sitelerin çoğunluğu flavin bağlı solunum kompleksleri ve süperoksit (O2● –) ve hidrojen peroksit (H2O2) karışımı üretmek dehydrogenases içerir. ROS üreten potansiyel izole mitokondri içinde bireysel siteleri doğru miktar antioksidan savunma sistemleri ve ayrıca O2●-/ h2O2formu yan reaksiyonlar varlığı nedeniyle zor olabilir. Mitokondriyal bioenergetics bozabilir nonspesifik inhibitörleri kullanımı da ROS yayın üretim diğer sitelerden değiştirerek ölçümleri olumsuz etkileyebilir. Burada, saflaştırılmış flavin bağlı dehydrogenases tarafından eş zamanlı ölçüm H2O2 serbest bırakmak ve Nikotinamid adenin dinükleotit (NADH) üretim için kolay bir yöntem mevcut. Burada kastedilen, örnek olarak saflaştırılmış pyruvate dehidrogenaz kompleksi (PDHC) ve α-ketoglutarate dehidrogenaz kompleksi (KGDHC) domuz kalp kökenli kullandık. Bu yöntemi doğru bir ölçü oranlarının yerli H2O2 yayın üretim bireysel siteleri tarafından ROS ve antioksidan sistemleri diğer potansiyel kaynakları ortadan kaldırarak olanak sağlar. Buna ek olarak, bu yöntem H2O2 serbest bırakmak ve enzim aktivitesi ve etkinliği testi ile taranması ve inhibitörleri ROS üretim için selectivity ilişkisi doğrudan karşılaştırması için izin verir. Genel olarak, bu yaklaşım ROS yayın izole mitokondri veya permeabilized kas fiber ile daha sofistike deneyler önce bireysel enzimler için yerel oranları derinlemesine değerlendirilmesi için izin verebilirsiniz.
Introduction
Besin metabolizma, nihai hedefi adenozin trifosfat (ATP) yapmaktır. Memeli hücrelerinde mitokondri, ATP karbon depolanan enerji dönüştürme çift membraned organelleri içinde oluşur. Karbon iki elektron taşıyıcıları, NADH ve flavin adenin dinükleotit (FADH2)1şekillendirme mitokondri tarafından yakılarak olduğunda ATP üretimi başladı. NADH ve FADH2 o zaman okside çoklu alt birim solunum kompleksleri tarafından ı ve II, sırasıyla ve elektron alıcısı moleküler oksijen (O2) karmaşık IV1için serbest elektron Guam’dan sürekli. Thermodynamically olumlu “yokuş aşağı” transferi elektron zinciri sonundaki O2 proton verileceği intermembrane birleştirilmiştir uzay kompleksleri tarafından ı, III ve IV. Bu bir transmembran elektrokimyasal gradyan proton (proton-sebep kuvvet), ATP2yapmak için karmaşık V tarafından dinleniyor Gibbs serbest enerjisi geçici bir form oluşturur. Elektron transferi reaksiyonlar mitokondri içinde mükemmel ATP üretimi için birleştiğinde değil. Krebs döngüsü ve solunum zinciri çeşitli noktalarda, elektron zamanından önce O2 forma ROS3ile etkileşim kurabilir. Mitokondri tarafından oluşturulan en biyolojik ilgili ROS O2● – ve H2O2‘ dir. Şimdi ne kadar O2● – kez mitokondri tarafından kurulan proksimal ROS olarak, üretim siteleri ücretsiz ile ilişkili olduğu O2● – ve H2O2, karışımı oluşturmak belirgin flavin protez radikal kimya4,5gruplandırır. Yüksek düzeylerde ROS oksidatif stres6‘ kaynaklanan hücre işlevi için gerekli biyolojik bileşenlerinin zarar tehlikeli olabilir. Ancak, düşük tutarları, mitokondrial ROS hayati sinyal işlevleri yerine getirmek. Örneğin, H2O2 sürümü mitokondri T hücre aktivasyonu, stres sinyal (örneğin, indüksiyon Nrf2 sinyal yollar), hücre çoğalması ve farklılaşma indüksiyon kontrolünde karıştığı olmuştur, insülin sinyal ve serbest bırakmak ve davranış7besleme. Önemli ROS sinyal gönderme işlevini anlama konusunda ilerlemeler kaydedilmiştir. Ancak, önemli soru hala cevap bekliyor hangi açısından enzimler mitokondri içinde en önemli kaynakları ve nasıl üretim kontrol olarak hizmet vermektedir.
ROS yayın üretim sitesi tarafından birkaç faktöre bağlıdır: 1) konsantrasyonu elektron bağış site, 2) elektron bağış sitesi, oksijen ve 4) konsantrasyon 3) erişim Redoks durumunu ve oksidasyon substrat3, türü 8 , 9. NADH ve membran potansiyel gücü konsantrasyonu da etkiler gibi ROS üretim8,10mitokondri içinde diğer faktörler. Örneğin, O2●-/ h2O2 tarafından üretimin saf PDHC veya KGDHC hızı artan NADH durumu5,11ile artar. Bu senaryoda, elektron geriye doğru PDHC ya da KGDHC,O2● // h2O2 üretim12sitesi E3 alt birim FAD Merkezi NADH akıyor. Benzer şekilde, NAD+ hükmü ROS yayın KGDHC12azalan ters etkiye sahiptir. Böylece, kontrol giriş veya çıkış elektron ROS üretim sitelerden ne kadar O2●-/ h2O2 oluşan değiştirebilirsiniz. Örneğin, PDHC veya CPI-613, analog, sonuçları bir neredeyse % 90 O2● –içinde/h2O2 üretim13azaltmak lipoic asit ile KGDHC E2 alt birim engelliyor. Kimyasal S-glutathionylation Katalizörler, diamide ve Ampisilin, hangi neredeyse O2●-/ h2O2 üretim PDHC veya KGDHC tarafından glutatyon e konjugasyon üzerinden kaldırılması ile benzer sonuçlar elde 2 alt birim14. E2 alt birim PDHC ve KGDHC ile elektron akışını engelleme için ticaret-off ROS oluşumuna elektron taşıma zinciri tarafından (örneğin, karmaşık III) azalır NADH üretim bir azalmadır. Bu da elektron taşıma zinciri tarafından ATP çıkış düşürebilir. Genel olarak, ROS üretim siteleri için elektron giriş kütük parçası O2●-/ h2O2 üretim kontrol son derece etkili bir anlamı olabilir.
Mitokondri 12’ye kadar potansiyel O2●-/ h2O2 kaynakları6içerebilir. Bu sitelerin çoğu flavin içeren O2● – ve H2O2karışımı oluşturan enzimler. Farklı yüzey ve önleyici bileşimleri kullanımı hangisitelerde oluşturan yüksek kapasiteli O2●-/ h2O2 solunum kompleksleri ve mitokondriyal dehydrogenases hizmet tanımlaması için izin verilen farklı dokuların3. PDHC ve KGDHC yüksek kapasiteli O2●-/ h2O2 kas ve karaciğer mitokondri13,15yayan siteleri hizmet gösterilmiştir. Ancak, mitokondri ve etkisi farklı substrat ve önleyici bileşimleri olan bireysel sitelerin potansiyel oluşturan O2●-/ h2O2 incelenmesi açısından bazı zorluklar kalır enzimler faaliyetleri. Bu istenmeyen yan reaksiyonlar (örneğin, O2●-/ h2O2 siteleri dışındaki faiz enzim tarafından oluşumu) varlığı nedeniyle, endojen besin (örneğin,yağ kirletici asitler) veya organelleri (örneğin, aynı zamanda O2●-/ h2O2şeklinde tanımladıkları) ve seçicilik eksikliği inhibitörleri kullanımı ve/veya tamamen ROS üretim inhibe değil bileşikler kullanımı. Belirli inhibitörleri Ayrıca mitokondriyal bioenergetics ve elektron akışı yönünü değiştirebilir ve bu üretimin diğer sitelerden ROS sürüm değiştirir ve sonuçları zihnimi karıştıran. O2●-/ h2O2 serbest bırakılması için bireysel sitelerinden mitokondri yapılan mutlak oranları da O2● – ve H2O2 yüksek konsantrasyonu nedeniyle ölçmek zordur matris ve intermembrane alanı içinde enzimler ortadan kaldırarak. Bu nedenle, O2●-/ h2O2 yayın ölçümleri ile engelleyebilir herhangi bir rakip tepkiler ortadan kaldırılması yüksek kapasiteli O2●-/ h2O2 belirlerken yararlı olabilir siteleri şekillendirme.
Burada, O2●-/ h2O2 üretim ve NADH oluşumu eşzamanlı incelenmesi için saflaştırılmış flavin bağımlı dehydrogenases tarafından sağlar basit bir yöntem mevcut. Arıtılmış enzimler kullanarak, istenmeyen yan reaksiyonlar oluşturan ROS ve enzimler aşağılayıcı ROS bırakmak daha doğru bir ölçü birimi yerel O2●-/ h2O2 üretim oranları için bireysel flavoenzymes için ortadan kaldırılabilir. Bu yöntem doğrudan O2●-/ h2O için kapasite farklı arıtılmış dehydrogenases veya ekran potansiyel siteye özgü inhibitörleri oluşturan O2●-/ h2O2 karşılaştırmak için kullanılabilir 2 serbest bırakmak. Son olarak, O2●-/ h2O2 ve NADH üretim aynı anda ölçme enzim aktivitesi ve ROS yayın kapasitesi arasındaki ilişkinin gerçek zamanlı bir değerlendirmesi için izin verebilirsiniz.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bu iletişim kuralı beri avantajlıdır, 1) bu aksi takdirde H2O2 algılama (örneğin, antioksidan sistemleri veya diğer kaynakları ROS), ile 2 engel olabilecek herhangi bir rakip tepkiler ortadan kaldırır) yerel oranı doğrudan bir değerlendirmesini sağlar ROS serbest bir flavin içeren mitokondrial dehidrogenaz tarafından 3) yerli karşılaştırmasını sağlar ROS yayın oranları iki veya daha fazla saf flavin tabanlı dehydrogenases, 4) oranı ROS yayın ve enzim aktivitesi …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu eser Doğa Bilimleri ve mühendislik Araştırma Konseyi, Kanada (NSERC) tarafından finanse edildi. Video üretim merkezi için yenilik öğretim ve öğrenme (CITL), Newfoundland Memorial Üniversitesi ile işbirliği içinde gerçekleştirilmiştir.
Materials
| Pyruvate dehydrogenase complex | SIGMA | P7032-10UN | purified flavoenzyme |
| alpha-ketoglutarate dehydrogenase complex | SIGMA | K1502-20UN | purified flavoenzyme |
| 30% hydrogen peroxide solution | SIGMA | HX0640-5 | reagent, standard curves |
| NAD+ | SIGMA | N0632-1G | reagent, activity/ROS release assay |
| NADH | SIGMA | N4505-100MG | reagent, standard curves |
| pyruvate | SIGMA | P2256-5G | reagent, activity/ROS release assay |
| alpha-ketoglutarate | SIGMA | 75892-25G | reagent, activity/ROS release assay |
| CoASH | SIGMA | C3019-25MG | reagent, activity/ROS release assay |
| thiamine pyrophosphate | SIGMA | C8754-1G | reagent, activity/ROS release assay |
| mannitol | SIGMA | M4125-100G | buffer component |
| Hepes | SIGMA | H3375-25G | buffer component |
| sucrose | SIGMA | S7903-250G | buffer component |
| EGTA | SIGMA | E3889-10G | buffer component |
| KMV | SIGMA | 198978-5G | reagent, ROS release inhibitor |
| CPI-613 | Santa Cruz | sc-482709 | reagent, ROS release inhibitor |
| SOD | SIGMA | S9697-15KU | reagent, ROS release detection |
| horseradish peroxidase | SIGMA | P8375-1KU | reagent, ROS release detection |
| Amplex Ultra Red | Thermofisher | A36006 | reagent, ROS release detection |
| Biotech Synergy 2 microplate reader | BioTek Instruments | microplate reader for assays | |
| Gen5 software | BioTek Instruments | software, used for collection of raw RFU | |
| Graphpad Prism | Graphpad software | software, data analysis | |
| Microsoft EXCEL | Microsoft | software, data analysis |
References
- Mailloux, R. J. Teaching the fundamentals of electron transfer reactions in mitochondria and the production and detection of reactive oxygen species. Redox Biol. 4, 381-398 (2015).
- Nicholls, D. G. Forty years of Mitchell’s proton circuit: From little grey books to little grey cells. Biochim Biophys Acta. 1777 (7-8), 550-556 (2008).
- Brand, M. D. Mitochondrial generation of superoxide and hydrogen peroxide as the source of mitochondrial redox signaling. Free Radic Biol Med. 100, 14-31 (2016).
- Massey, V. Activation of molecular oxygen by flavins and flavoproteins. J Biol Chem. 269 (36), 22459-22462 (1994).
- Mailloux, R. J., Gardiner, D., O’Brien, M. 2-Oxoglutarate dehydrogenase is a more significant source of O2(.-)/H2O2 than pyruvate dehydrogenase in cardiac and liver tissue. Free Radic Biol Med. 97, 501-512 (2016).
- Sies, H., Berndt, C., Jones, D. P. Oxidative Stress. Annu Rev Biochem. 86, 715-748 (2017).
- Kuksal, N., Chalker, J., Mailloux, R. J. Review. Progress in understanding the molecular oxygen paradox – function of mitochondrial reactive oxygen species in cell signaling. Biol Chem. , (2017).
- Murphy, M. P. How mitochondria produce reactive oxygen species. Biochem J. 417 (1), 1-13 (2009).
- Wong, H. S., Dighe, P. A., Mezera, V., Monternier, P. A., Brand, M. D. Production of superoxide and hydrogen peroxide from specific mitochondrial sites under different bioenergetic conditions. J Biol Chem. , (2017).
- Harper, M. E., Green, K., Brand, M. D. The efficiency of cellular energy transduction and its implications for obesity. Annu Rev Nutr. 28, 13-33 (2008).
- Ambrus, A., et al. Formation of reactive oxygen species by human and bacterial pyruvate and 2-oxoglutarate dehydrogenase multienzyme complexes reconstituted from recombinant components. Free Radic Biol Med. 89, 642-650 (2015).
- Tretter, L., Adam-Vizi, V. Generation of reactive oxygen species in the reaction catalyzed by alpha-ketoglutarate dehydrogenase. J Neurosci. 24 (36), 7771-7778 (2004).
- Slade, L., et al. Examination of the superoxide/hydrogen peroxide forming and quenching potential of mouse liver mitochondria. Biochim Biophys Acta. 1861 (8), 1960-1969 (2017).
- O’Brien, M., Chalker, J., Slade, L., Gardiner, D., Mailloux, R. J. Protein S-glutathionylation alters superoxide/hydrogen peroxide emission from pyruvate dehydrogenase complex. Free Radic Biol Med. 106, 302-314 (2017).
- Quinlan, C. L., et al. The 2-oxoacid dehydrogenase complexes in mitochondria can produce superoxide/hydrogen peroxide at much higher rates than complex I. J Biol Chem. 289 (12), 8312-8325 (2014).
- Mailloux, R. J., Craig Ayre, D., Christian, S. L. Induction of mitochondrial reactive oxygen species production by GSH mediated S-glutathionylation of 2-oxoglutarate dehydrogenase. Redox Biol. 8, 285-297 (2016).
- Mailloux, R. J., Gardiner, D., O’Brien, M. 2-Oxoglutarate dehydrogenase is a more significant source of O2(.-)/H2O2 than pyruvate dehydrogenase in cardiac and liver tissue. Free Radic Biol Med. 97, 501-512 (2016).
- Ambrus, A., Adam-Vizi, V. Human dihydrolipoamide dehydrogenase (E3) deficiency: Novel insights into the structural basis and molecular pathomechanism. Neurochem Int. , (2017).
- Young, A., Gardiner, D., Brosnan, M. E., Brosnan, J. T., Mailloux, R. J. Physiological levels of formate activate mitochondrial superoxide/hydrogen peroxide release from mouse liver mitochondria. FEBS Lett. 591 (16), 2426-2438 (2017).
- Fisher-Wellman, K. H., et al. Mitochondrial glutathione depletion reveals a novel role for the pyruvate dehydrogenase complex as a key H2O2-emitting source under conditions of nutrient overload. Free Radic Biol Med. 65, 1201-1208 (2013).
- Kussmaul, L., Hirst, J. The mechanism of superoxide production by NADH:ubiquinone oxidoreductase (complex I) from bovine heart mitochondria. Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (20), 7607-7612 (2006).
- Huang, L. S., Borders, T. M., Shen, J. T., Wang, C. J., Berry, E. A. Crystallization of mitochondrial respiratory complex II from chicken heart: a membrane-protein complex diffracting to 2.0. A. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 61 (Pt 4), 380-387 (2005).
- Yeh, J. I., Chinte, U., Du, S. Structure of glycerol-3-phosphate dehydrogenase, an essential monotopic membrane enzyme involved in respiration and metabolism. Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (9), 3280-3285 (2008).
