Misura simultanea di perossido di idrogeno/del superossido e produzione di NADH di Flavin-contenente deidrogenasi mitocondriale
Summary
I mitocondri contengono parecchi enzimi flavina-dipendenti in grado di produrre le specie reattive dell’ossigeno (ROS). Monitoraggio ROS rilascio dai singoli siti nei mitocondri è difficile a causa di reazioni collaterali indesiderate. Presentiamo un metodo semplice e poco costoso per valutazione diretta delle tariffe native per rilascio ROS mediante flavoenzymes purificata e micropiastre fluorometria.
Abstract
È stato segnalato che i mitocondri possono contenere fino a 12 sorgenti enzimatiche di specie reattive dell’ossigeno (ROS). Una maggioranza di questi siti sono dipendenti da flavina complessi respiratori e deidrogenasi che producono una miscela di superossido (O2● –) e perossido di idrogeno (H2O2). Quantificazione accurata del potenziale produzione di ROS di singoli siti in mitocondri isolati può essere difficile a causa della presenza di sistemi di difesa antiossidanti e reazioni secondarie che formano anche O2●-/ h2O2. Uso di inibitori non specifici che possono interferire con bioenergetica mitocondriale può anche compromettere misure alterando rilascio ROS da altri siti di produzione. Qui, presentiamo un metodo semplice per la misura simultanea di nicotinamide adenindinucleotide (NADH) produzione e rilascio di H2O2 da purificato legata flavina deidrogenasi. Per i nostri scopi qui, abbiamo usato complesso di purificato piruvato deidrogenasi (PDHC) e α-chetoglutarato deidrogenasi complessa (KGDHC) di origine porcina cuore come esempi. Questo metodo consente una misurazione accurata del nativo H2O2 tariffe rilascio di singoli siti di produzione eliminando altri potenziali fonti di sistemi ROS e antiossidante. Inoltre, questo metodo consente un confronto diretto del rapporto tra rilascio di H2O2 e l’attività enzimatica e la proiezione dell’efficacia e la selettività degli inibitori per la produzione di ROS. Nel complesso, questo approccio può consentire la valutazione approfondita dei nativi tassi di rilascio ROS per singoli enzimi prima conducendo esperimenti più sofisticati con mitocondri isolati o permeabilized della fibra di muscolo.
Introduction
L’obiettivo finale del metabolismo dei nutrienti è di rendere l’adenosina trifosfato (ATP). In cellule di mammifero, ciò si verifica nei mitocondri, organelli a membrana doppia che convertono l’energia immagazzinata in carbonio in ATP. Quando il carbone viene bruciato dai mitocondri formando due trasportatori di elettroni, NADH e flavina adenina dinucleotide (FADH2)1inizia la produzione di ATP. NADH e FADH2 sono quindi ossidato da complessi respiratori multi-unità secondaria I e II, rispettivamente, e gli elettroni liberati sono traghettati al terminale dell’elettrone accettore molecolare ossigeno (O2) al complesso IV1. Il thermodinamicamente favorevole “in discesa” trasferimento di elettroni a O2 all’estremità della catena è accoppiato all’esportazione di protoni nel intermembrane spazio dai complessi I, III e IV. Questo crea un gradiente elettrochimico transmembrana di protoni (Forza Protonomotrice), una forma temporanea di energia libera di Gibbs che è sfruttato da V complessa fare ATP2. Reazioni di trasferimento di elettroni nei mitocondri non sono perfettamente accoppiate alla produzione di ATP. In vari punti del ciclo di Krebs e catena respiratoria, elettroni prematuramente possono interagire con O2 al modulo ROS3. Il più biologicamente rilevante ROS generato dai mitocondri è O2● – e H2O2. Anche se O2● – è spesso considerato il ROS prossimale formato dai mitocondri, è ora evidente che siti di produzione formano una miscela di O2● – e H2O2, che è associato con il libero radicale chimica di flavin protesica dei gruppi4,5. Ad alti livelli, il ROS può essere pericoloso, danneggiando costituenti biologici necessari per la funzione delle cellule con conseguente stress ossidativo6. Tuttavia, a basse quantità, ROS mitocondriale soddisfare funzioni vitali di segnalazione. Per esempio, rilascio di H2O2 dai mitocondri è stata implicata nel controllo di attivazione delle cellule T, sforzo segnalazione (ad es., induzione delle vie di segnalazione Nrf2), l’induzione della proliferazione e differenziazione, segnalazione dell’insulina e rilascio e alimentazione comportamento7. Notevoli progressi nella comprensione della funzione di segnalazione di ROS. Tuttavia, importanti domande rimangono ancora rispetto alla quale gli enzimi nei mitocondri servono come le fonti più importanti e come produzione è controllata.
Rilascio ROS da un sito di produzione dipende da diversi fattori: 1) la concentrazione di donare l’elettrone del sito, 2) lo stato redox del sito donare elettroni, 3) accesso ad ossigeno e 4) la concentrazione e il tipo di substrato di ossidazione3, 8 , 9. nei mitocondri, altri fattori come la concentrazione di forza potenziale di membrana e NADH inoltre influenzare ROS produzione8,10. Ad esempio, il tasso di O2●-/ h2O2 produzione di purificato PDHC o KGDHC aumenta con crescente NADH disponibilità5,11. In questo scenario, gli elettroni scorrono all’indietro dal NADH al centro FAD nella subunità E3 di PDHC o KGDHC, il sito per O2●-/ h2O2 produzione12. Allo stesso modo, la fornitura di NAD+ ha l’effetto opposto, diminuire il rilascio ROS da KGDHC12. Così, controllo entrata o uscita di elettroni dai siti di produzione di ROS può alterare quanto O2●-/ h2O2 è formata. Per esempio, bloccando la subunità di2 E di PDHC o KGDHC con CPI-613, un analogico, risulta in un quasi il 90% diminuzione O2●-/ h2O2 produzione13l’acido lipoico. Risultati simili possono essere ottenuti con la chimica S-glutationilazione catalizzatori, diammide e disulfiram, che quasi abolire O2●-/ h2O2 produzione di PDHC o KGDHC tramite la coniugazione del glutatione e 2 subunità14. Il trade-off per bloccare il flusso di elettroni attraverso la subunità di2 E di PDHC e KGDHC è una diminuzione nella produzione di NADH che diminuisce la formazione di ROS dalla catena di trasporto dell’elettrone (per esempio, complesso III). Questo può anche diminuire ATP uscita dalla catena di trasporto degli elettroni. Nel complesso, bloccando l’entrata di elettroni ai siti di produzione di ROS può essere un mezzo molto efficace di controllare O2●-/ h2O2 produzione.
I mitocondri possono contenere fino a 12 potenziali O2●-/ h2O2 fonti6. Flavin-contenente la maggior parte di questi siti sono enzimi che generano una miscela di O2● – e H2O2. Uso di qualsiasi tipologia di substrato e combinazioni di inibitore hanno permesso l’identificazione di cui complessi respiratori e deidrogenasi mitocondriale servono come ad alta capacità O2●-/ h2O2 formando siti in diversi tessuti3. PDHC e KGDHC sono stati indicati per servire come ad alta capacità O2●-/ h2O2 siti che emettono in muscolo e mitocondri del fegato13,15. Restano tuttavia alcune difficoltà per quanto riguarda l’esame dell’O2●-/ h2O2 di singoli siti nei mitocondri e l’impatto che qualsiasi tipologia di substrato e combinazioni di inibitore hanno il potenziale di formazione l’attività degli enzimi. Questo è dovuto alla presenza di reazioni collaterali indesiderate (ad es., la formazione di O2●-/ h2O2 da siti diversi dall’enzima di interesse), contaminando endogene nutrienti (ad es.,grassi acidi) o organelli (ad es., peroxisomes che formano anche O2●-/ h2O2) e l’uso di inibitori che la mancanza di selettività e all’impiego di composti che completamente non inibiscono la produzione di ROS. Alcuni inibitori possono anche alterare la bioenergetica mitocondriale e la direzione di flusso dell’elettrone, e questo altera il rilascio ROS da altri siti di produzione e confonde i risultati. Tariffe di assoluta per O2●/h2O2 rilascio dai singoli siti in mitocondri sono anche difficili da quantificare dovuta all’alta concentrazione di O2● – e H2O2 eliminando gli enzimi nello spazio matrice e intermembrane. Pertanto, eliminazione di eventuali reazioni concorrenti che possono interferire con O2●-/ h2O2 rilascio misure può essere utile quando si identificano ad alta capacità O2●-/ h2O2 formando siti.
Qui, presentiamo un metodo semplice che permette l’esame simultaneo di O2●-/ h2O2 produzione e formazione di NADH di purificato dipendenti da flavina deidrogenasi. Utilizzando enzimi purificati, ROS formando reazioni collaterali indesiderate e ROS enzimi degradativi può essere eliminato consentendo una misura più accurata della nativa O2●-/ h2O2 tassi di produzione per singoli flavoenzymes. Questo metodo può essere utilizzato per confrontare direttamente l’O2●-/ h2O2 formando la capacità di diversi deidrogenasi purificati o per potenziali inibitori site-specific schermo per O2●-/ h2O versione 2 . Infine, misura O2●-/ h2O2 e la produzione di NADH contemporaneamente può consentire una valutazione in tempo reale della relazione tra l’attività dell’enzima e la capacità di rilascio ROS.
Protocol
Representative Results
Discussion
Questo protocollo è vantaggioso poiché, 1) Elimina eventuali reazioni concorrenti che altrimenti potrebbero interferire con il rilevamento di H2O2 (ad esempio, i sistemi antiossidanti o altre fonti di ROS), 2) fornisce una valutazione diretta del tasso nativo di ROS di rilascio di una deidrogenasi mitocondriale di flavin-contenente, 3) permette il confronto del nativo ROS rilasciare tariffe di due o più purificato basati su flavina deidrogenasi, 4) può consentire un confronto diretto de…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Quest’opera è stata finanziata dalle scienze naturali e ingegneria ricerca Consiglio del Canada (NSERC). Produzione video è stato realizzato in collaborazione con il centro per l’innovazione nell’insegnamento e apprendimento (CITL) al Memorial University of Newfoundland.
Materials
| Pyruvate dehydrogenase complex | SIGMA | P7032-10UN | purified flavoenzyme |
| alpha-ketoglutarate dehydrogenase complex | SIGMA | K1502-20UN | purified flavoenzyme |
| 30% hydrogen peroxide solution | SIGMA | HX0640-5 | reagent, standard curves |
| NAD+ | SIGMA | N0632-1G | reagent, activity/ROS release assay |
| NADH | SIGMA | N4505-100MG | reagent, standard curves |
| pyruvate | SIGMA | P2256-5G | reagent, activity/ROS release assay |
| alpha-ketoglutarate | SIGMA | 75892-25G | reagent, activity/ROS release assay |
| CoASH | SIGMA | C3019-25MG | reagent, activity/ROS release assay |
| thiamine pyrophosphate | SIGMA | C8754-1G | reagent, activity/ROS release assay |
| mannitol | SIGMA | M4125-100G | buffer component |
| Hepes | SIGMA | H3375-25G | buffer component |
| sucrose | SIGMA | S7903-250G | buffer component |
| EGTA | SIGMA | E3889-10G | buffer component |
| KMV | SIGMA | 198978-5G | reagent, ROS release inhibitor |
| CPI-613 | Santa Cruz | sc-482709 | reagent, ROS release inhibitor |
| SOD | SIGMA | S9697-15KU | reagent, ROS release detection |
| horseradish peroxidase | SIGMA | P8375-1KU | reagent, ROS release detection |
| Amplex Ultra Red | Thermofisher | A36006 | reagent, ROS release detection |
| Biotech Synergy 2 microplate reader | BioTek Instruments | microplate reader for assays | |
| Gen5 software | BioTek Instruments | software, used for collection of raw RFU | |
| Graphpad Prism | Graphpad software | software, data analysis | |
| Microsoft EXCEL | Microsoft | software, data analysis |
References
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