活性酸素・過酸化水素とフラビン含有ミトコンドリア脱水素酵素による NADH 生産の同時測定
Summary
ミトコンドリアは、活性酸素種 (ROS) を生成することができますいくつかのフラビン依存型酵素を含まれています。ROS を監視ミトコンドリアの個々 のサイトからのリリースは不要な副反応のために挑戦です。簡単、安価な精製フラビン酵素とマイクロ プレート蛍光分析を使用して、ROS リリース ネイティブ料金を直接評価法を提案します。
Abstract
それは、ミトコンドリアが活性酸素種 (ROS) の最大 12 酵素源を含めることができます報告されています。これらのサイトの大半には、フラビン依存型呼吸鎖複合体と脱水素酵素活性酸素 (O2● –) と過酸化水素 (H2O2) の混合物を生成するがあります。ミトコンの個々 のサイトの ROS 産生能の定量の正確さは抗酸化防衛システムとO2● –/H2O2を形成するも副反応の存在のために困難なことができます。ミトコンドリアの生体エネルギーを乱すことができる非特異的阻害剤の使用は、生産の他のサイトから ROS のリリースを変更することにより測定を脅かされる可能性も。精製フラビン結合脱水素酵素によって H2O2リリースとニコチン酸アミドアデニンジヌクレオチド (NADH) 生産の同時測定のための簡単な方法を紹介します。我々 の目的はここで、例として精製されたピルビン酸脱水素酵素複合体 (PDHC) と α-ケトグルタル酸デヒドロゲナーゼ複合体 (KGDHC) のブタ心臓起源を使いました。このメソッドはネイティブによって生産の個々 のサイトの H2O2解放率の正確な測定のため活性酸素と抗酸化システムの他の潜在的な原因を排除することによってできます。さらに、このメソッドは、H2O2リリースと酵素活性と有効性のスクリーニングと活性酸素産生の阻害の選択性の関係の直接比較のためことができます。全体的に、このアプローチを分離ミトコンドリアやグリセリン筋線維でのより高度な実験を行う前に個々 の酵素の ROS リリースのネイティブ速度の詳細な評価を許可できます。
Introduction
栄養代謝の究極の目標は、アデノシン三リン酸 (ATP) をすることです。哺乳類セルのこれはカーボンで ATP に蓄えられたエネルギーを変換する二重の機能を担った細胞小器官ミトコンドリアで発生します。ATP の生産が始まる炭素がミトコンドリア NADH およびフラビンアデニンジヌクレオチド (FADH2)1の 2 つの電子キャリアを形成によって燃焼させる。NADH および FADH2によって酸化されて複数のサブユニット呼吸鎖複合体 I および II、それぞれ、および解放された電子が複雑な IV1ターミナル電子アクセプター分子酸素 (O2) へフェリーで行きます。熱力学的に有利な「下り坂」電子の移動 O2チェーンの終わりには、intermembrane に陽子の輸出に結合複合体 I、III、および IV スペースします。これは、陽子 (プロトン動機力)、2ATP を作る複雑な V によってタップされてギブス自由エネルギーの一時的な形式の貫通型電気化学的勾配を作成します。ミトコンドリアの電子伝達反応は、ATP の生産に完全には結合されていません。クレブスと呼吸鎖の様々 なポイント、電子途中で O2 ROS3形態にやり取りできます。ミトコンドリアによって生成される最も生物学的に関連する活性酸素は O2● –と H2O2。O2● –ミトコンドリアによって形成された近位の ROS と考えは多くの場合、生産のサイトに対して、自由に関連付けられている O2● –と H2O2の混合物を形成することは明白であります。人工フラビンの根本的な化学グループ4,5です。高いレベルで ROS、危険、酸化遭難6細胞機能に必要な生体成分の損傷です。ただし、低額でミトコンドリア ROS は重要なシグナリングの機能を果たします。例えば、ミトコンドリアから放出される H2O2を制御する T 細胞の活性化、ストレス シグナル (例えば、Nrf2 シグナル伝達経路の誘導)、細胞増殖や分化の誘導に関与しています。インスリン シグナルしリリース、および動作7を供給します。活性酸素のシグナル伝達機能を理解する上でかなりの進歩をしました。ただし、重要な質問はまだ残っているに関してミトコンドリアの酵素として最も重要な源および生産を制御する方法。
いくつかの要因に依存する生産のサイトによって ROS リリース: 1) 濃度の電子の寄付サイト、2) 3) 酸素、および 4) 濃度へのアクセス、電子寄付サイトの酸化還元状態と酸化基板3,の種類8,9. NADH および膜の潜在的な強度の濃度も ROS 生産8,10に影響を与えるようなミトコンドリアの他の要因。たとえば、O2● –/H2O2生産精製 PDHC または KGDHC の率は増加 NADH 可用性5,11に増加します。このシナリオでは、PDHC または KGDHC、O2● –/H2O2生産12サイトの E3サブユニットの流行中心に NADH から電子が逆流です。同様に、NAD+の規定は KGDHC12から ROS リリースを減少、反対の効果を持ちます。したがって、活性酸素産生のサイトからの電子制御の出入りを変更できますどのくらい O2● –/H2O2が形成されます。例えば、PDHC の消費者物価指数-613、アナログ、ほぼ 90% 減少 O2● –/H2O2生産13リポ酸と KGDHC E2サブユニットをブロックします。化学 S glutathionylation 触媒、著者、ジスルフィラム、O2● –/H2O2 PDHC または KGDHC を介して生産の E にグルタチオン抱合をほぼ廃止で同様の結果が得られます2サブユニット14。PDHC の KGDHC E2サブユニットを介して電子の流れをブロックするためのトレードオフ (例えば、複合体 III) の電子輸送鎖によって ROS の生成を減少する NADH の生産の減少であります。これはまた電子輸送鎖によって ATP の出力を減らすことができます。全体的に、活性酸素産生のサイトに電子エントリをブロック O2● –/H2O2生産を制御する非常に効果的な手段をすることができます。
ミトコンドリアは、最大 12 潜在的な O2● –/H2O2ソース6を含めることができます。これらのサイトのほとんどは、フラビン含有 O2● –と H2O2の混合物を生成する酵素。呼吸鎖複合体とミトコンドリアの脱水素酵素機能大容量 O2● –/H2O2のサイトを形成する識別に対して異なる基質と阻害剤の組み合わせの使用を許可しました。異なったティッシュ3。PDHC と KGDHC は、筋肉と肝臓のミトコンドリア13,15発光サイト大容量O2● –/H2O2として示されています。ただし、いくつかの困難のまま O2● –/H2O2異なる基質と阻害剤の組み合わせは、ミトコンドリアと影響の個々 のサイトの潜在的な形成の検討に関して酵素の活動。これは、望ましくない副反応 (例えばO2● –/H2O2興味の酵素以外のサイトでの形成) の存在のために汚染内因性栄養素 (例えば、脂肪酸酸) または細胞内小器官 (例えば、ペルオキシソームO2● –/H2O2を形作る)、選択性を欠いている阻害剤の使用や活性酸素産生を完全に抑制しない化合物の使用。特定の阻害剤ミトコンドリアバイオエナジェティックスと電子流れの方向を変更することも、これは生産の他のサイトから ROS リリースを変更し、結果を混同します。O2●/H2O2リリース ミトコンドリアの個々 のサイトからのための絶対速度 O2● –と H2O2の高濃度のため定量化することは困難です。行列と intermembrane スペースで酵素を除去します。したがって、O2● –/H2O2リリース測定を妨害することができます任意の競合反応の除去することができます大容量 O2● –/H2O2 を識別します。サイトを形成します。
脱水素酵素フラビン依存型精製によって O2● –/H2O2生産と NADH 形成の同時受験可能にする簡単な方法を紹介します。精製された酵素を使用してに、原産 O2● –/H2O2生産率である個々 のフラビン酵素のためのより正確な測定を可能にすると、不要な ROS 形成側の反応と活性酸素分解酵素を除去ことができます。このメソッドを使用して直接比較、O2● –/H2O2 O2● –/H2O の異なる精製脱水素酵素または画面潜在的な部位特異的阻害剤の容量を形成できます。2リリース。最後に、O2● –/H2O2と NADH 生産を同時に測定、酵素と活性酸素放出能の関係のリアルタイム評価できます。
Protocol
Representative Results
Discussion
このプロトコルは有利なので、1) 2 H2O2検出など、抗酸化システム (ROS の他の情報源)、妨げる可能性がありますそうでなければ任意の競合反応を排除) のネイティブ速度の直接評価ROS をフラビン含有ミトコンドリア脱水素酵素、3 によって解放) ネイティブを比較できます ROS リリース 2 つの率またはより精製脱フラビン ベース、4) ROS のリリースと酵素の活性や 5 の率の…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この作品は、自然な科学および工学研究審議会のカナダ (レベル) によって賄われていた。ビデオ制作は、教育と学習 (CITL) ニューファウンドランドの記念大学のイノベーション センターと共同で実施されました。
Materials
| Pyruvate dehydrogenase complex | SIGMA | P7032-10UN | purified flavoenzyme |
| alpha-ketoglutarate dehydrogenase complex | SIGMA | K1502-20UN | purified flavoenzyme |
| 30% hydrogen peroxide solution | SIGMA | HX0640-5 | reagent, standard curves |
| NAD+ | SIGMA | N0632-1G | reagent, activity/ROS release assay |
| NADH | SIGMA | N4505-100MG | reagent, standard curves |
| pyruvate | SIGMA | P2256-5G | reagent, activity/ROS release assay |
| alpha-ketoglutarate | SIGMA | 75892-25G | reagent, activity/ROS release assay |
| CoASH | SIGMA | C3019-25MG | reagent, activity/ROS release assay |
| thiamine pyrophosphate | SIGMA | C8754-1G | reagent, activity/ROS release assay |
| mannitol | SIGMA | M4125-100G | buffer component |
| Hepes | SIGMA | H3375-25G | buffer component |
| sucrose | SIGMA | S7903-250G | buffer component |
| EGTA | SIGMA | E3889-10G | buffer component |
| KMV | SIGMA | 198978-5G | reagent, ROS release inhibitor |
| CPI-613 | Santa Cruz | sc-482709 | reagent, ROS release inhibitor |
| SOD | SIGMA | S9697-15KU | reagent, ROS release detection |
| horseradish peroxidase | SIGMA | P8375-1KU | reagent, ROS release detection |
| Amplex Ultra Red | Thermofisher | A36006 | reagent, ROS release detection |
| Biotech Synergy 2 microplate reader | BioTek Instruments | microplate reader for assays | |
| Gen5 software | BioTek Instruments | software, used for collection of raw RFU | |
| Graphpad Prism | Graphpad software | software, data analysis | |
| Microsoft EXCEL | Microsoft | software, data analysis |
References
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