Samtidig måling af superoxid/Hydrogen Peroxid og NADH produktion af Flavin-holdige mitokondrie Dehydrogenases
Summary
Mitokondrier indeholder flere flavin-afhængige enzymer, der kan producere reaktive ilt arter (ROS). Overvågning af ROS er udgivelse fra individuelle websteder i mitokondrier udfordrende på grund af uønskede side reaktioner. Vi præsenterer en nem og billig metode til direkte vurdering af indfødte satser for ROS udgivelse ved hjælp af renset flavoenzymes og mikrotiterplade fluorometry.
Abstract
Det er blevet rapporteret, at mitokondrier kan indeholde op til 12 enzymatisk kilder af reaktive ilt arter (ROS). Et flertal af disse websteder omfatter flavin-afhængige respiratorisk komplekser og dehydrogenases, der producerer en blanding af superoxid (O2● –) og hydrogenperoxid (H2O2). Nøjagtig kvantificering af individuelle websteder i isolerede mitochondrier ROS-producerende potentiale kan blive udfordrende på grund af tilstedeværelsen af antioxidant forsvarssystemer og side reaktioner, som også danner O2● –h2O2. Brug af uspecifikke inhibitorer, der kan forstyrre mitokondrie bioenergetik kan også svække målinger ved at ændre ROS udgivelse fra andre steder i produktionen. Her præsenterer vi en nem metode til samtidig måling af H2O2 release og nicotinamid-adenin-dinucleotid (NADH) produktion af renset flavin-knyttet dehydrogenases. For vores formål her, har vi brugt renset pyruvat dehydrogenase komplekset (PDHC) og α-ketoglutarat dehydrogenase kompleks (KGDHC) af svin hjerte oprindelse som eksempler. Denne metode giver mulighed for en nøjagtig måling af indfødte H2O2 release satser af enkelte steder i produktionen ved at eliminere andre potentielle kilder til ROS og antioxidant systemer. Desuden, denne metode giver mulighed for en direkte sammenligning af forholdet mellem H2O2 release og enzymaktivitet og screening af effektiviteten og selektivitet af inhibitorer for ROS produktion. Samlet set kan denne tilgang for dybdegående vurdering af indfødte satser af ROS udgivelse for enkelte enzymer før gennemføre mere avancerede eksperimenter med isolerede mitochondrier eller permeabilized muskelfiber.
Introduction
Det ultimative mål af næringsstoffer stofskifte er at gøre adenosin trifosfat (ATP). I pattedyrceller sker dette i mitokondrierne, dobbelt-membraned organeller, at omforme energien gemt i kulstof i ATP. Produktionen af ATP starter da kulstof er forbrændt af mitokondrier danner to elektron luftfartsselskaber, NADH og flavin-adenin-dinucleotid (FADH2)1. NADH og FADH2 derefter oxideres af multi subunit respiratorisk komplekser I og II, henholdsvis, og de frigjorte elektroner er færget til terminal elektron acceptor Molekylær ilt (O2) på komplekse IV1. Termodynamisk gunstig “downhill” overførsel af elektroner til O2 i slutningen af kæden er koblet til eksport af protoner ind i intermembrane plads ved komplekser I, III og IV. Dette skaber en transmembrane elektrokemiske gradient af protoner (proton-motor), en midlertidig form for Gibbs fri energi, der er tappet ved komplekse V at gøre ATP2. Elektron overførsel reaktioner i mitokondrier er ikke helt koblet til ATP produktion. På forskellige punkter i Krebs cyklus og respiratoriske kæden, kan elektroner tidligt interagere med O2 til form ROS3. De mest biologisk relevante ROS genereret af mitokondrier er O2●- og H2O2. Selvom O2● – betragtes ofte den proksimale ROS dannet af mitokondrier, er det nu indlysende, at websteder af produktionen danner en blanding af O2●- og H2O2, som er forbundet med den frie radikale kemi af flavin proteser grupper4,5. På højt niveau, kan ROS blive farlige, skadelige biologiske bestanddele kræves for cellefunktion resulterer i oxidative nød6. Dog på lavt beløb opfylde mitokondrie ROS vitale signaling funktioner. For eksempel, har H2O2 udgivelse fra mitokondrier været impliceret i styring af T-celle aktivering, stress signalering (fx, induktion af Nrf2 signaling veje), induktion af celleproliferation og differentiering, insulin signalering og frigivelse, og fodring adfærd7. Har gjort betydelige fremskridt i forståelsen af funktionen signalering af ROS. Imidlertid vigtigt spørgsmål er stadig som enzymer i mitokondrierne tjene som de vigtigste kilder og hvordan produktion er kontrolleret.
ROS udgivelse af et websted produktion afhænger af flere faktorer: 1) koncentrationen af elektron donere site, 2) elektron donere site, 3) adgang til ilt, og 4) den koncentration redox tilstand og type af oxidation substrat3, 8 , 9. i mitokondrierne, andre faktorer som koncentrationen af NADH og membran potentielle styrke også påvirke ROS produktion8,10. For eksempel, stiger satsen for O2● –h2O2 produktion af renset PDHC eller KGDHC med stigende NADH tilgængelighed5,11. I dette scenario, elektroner flyde baglæns fra NADH til byens FAD i E3 subunit af PDHC eller KGDHC, stedet for O2● –h2O2 produktion12. Tilsvarende har bestemmelse af NAD+ den modsatte effekt, faldende ROS udgivelse fra KGDHC12. Således kan kontrollerende indpassage eller udpassage af elektroner fra websteder af ROS produktion ændre, hvor meget O2● –h2O2 er dannet. For eksempel, blokerer E2 subunit af PDHC eller KGDHC med CPI-613, en analog, resulterer i en næsten 90% fald i O2● –h2O2 produktion13lipoinsyre. Lignende resultater kan opnås med kemiske S-glutathionylation katalysatorer, diamide og disulfiram, som næsten afskaffer O2● –h2O2 produktion af PDHC eller KGDHC via konjugation af glutathion til E 2 subunit14. Trade-off for at blokere elektron flow gennem E2 subunit af PDHC og KGDHC er et fald i NADH produktion, som mindsker ROS dannelsen af elektron transportkæden (f.eks.komplekse III). Dette kan også mindske ATP produktion af elektron transportkæden. Samlet set kan blokering elektron adgang til websteder af ROS produktion være et yderst effektivt middel til at kontrollere O2● –h2O2 produktion.
Mitokondrier kan indeholde op til 12 potentielle O2● –h2O2 kilder6. De fleste af disse websteder er flavin-holdige enzymer, som skaber en blanding af O2●- og H2O2. Brug af forskellige substrat og inhibitor kombinationer har tilladt for identifikation som respiratorisk komplekser og mitokondriel dehydrogenases tjene som høj kapacitet O2● –h2O2 danner websteder i forskellige væv3. PDHC og KGDHC har vist sig at fungere som høj kapacitet O2● –h2O2 udsender websteder i muskel og lever mitokondrier13,15. Dog stadig nogle vanskeligheder med hensyn til behandlingen af O2● –h2O2 udgør potentielle af individuelle websteder i mitokondrierne og indvirkningen, som forskellige substrat og inhibitor kombinationer har på aktiviteterne i enzymerne. Dette på grund af tilstedeværelsen af uønskede side reaktioner (fx, dannelsen af O2● –h2O2 af sites end enzym af interesse), kontaminerende endogene næringsstoffer (f.eks.fedtsyrer syrer) eller organeller (f.eks., peroxisomer, som også danner O2● –h2O2), og brugen af hæmmere, der mangler selektivitet, og/eller anvendelse af stoffer, der ikke fuldt hæmmer ROS produktion. Visse hæmmere kan også ændre mitokondrie bioenergetik og elektron flowretningen, og dette ændrer ROS udgivelse fra andre steder i produktionen og tilintetgør resultater. Absolut satserne for O2● –h2O2 -udgivelsen fra individuelle websteder i mitokondrier er også vanskeligt at kvantificere på grund af den høje koncentration af O2●- og H2O2 at fjerne enzymer i matrix og intermembrane pladsen. Derfor, fjernelse af eventuelle konkurrerende reaktioner, der kan forstyrre O2● –h2O2 release målinger kan være nyttige, når du identificerer høj kapacitet O2●-h2O2 danner websteder.
Her præsenterer vi en simpel metode, der giver mulighed for den samtidige undersøgelse af O2● –h2O2 produktion og NADH dannelsen af renset flavin-afhængige dehydrogenases. Ved hjælp af renset enzymer, uønskede ROS danner side reaktioner og ROS nedværdigende enzymer kan elimineres giver mulighed for en mere nøjagtig måling af indfødte O2●h2O2 produktion af satserne for individuelle flavoenzymes. Denne metode kan bruges til at direkte sammenligne O2● –h2O2 danner kapacitet af forskellige renset dehydrogenases eller at skærmen potentielle lokationsspecifikke hæmmere for O2●-h2O 2 udgivelse. Endelig kan måling O2● –h2O2 og NADH produktion samtidigt tillade en real-time vurdering af forholdet mellem enzymaktivitet og ROS udgivelse kapacitet.
Protocol
Representative Results
Discussion
Denne protokol er fordelagtige siden, 1) det eliminerer eventuelle konkurrerende reaktioner, der måske ellers forstyrre H2O2 påvisning (fx, antioxidant systemer eller andre kilder til ROS), 2) giver en direkte vurdering af de indfødte i ROS frigivelse af en flavin-holdige mitokondrie dehydrogenase, 3) giver mulighed for sammenligning af indfødte ROS frigive satser af to eller flere renset flavin-baseret dehydrogenases, 4) kan give mulighed for en direkte sammenligning af antallet af ROS…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbejde blev finansieret af Natural Sciences and Engineering Research Rådet i Canada (NSERC). Video produktion blev gennemført i samarbejde med Center for Innovation inden for undervisning og læring (uafhængige Transaktionsjournal) ved Memorial Universitet af Newfoundland.
Materials
| Pyruvate dehydrogenase complex | SIGMA | P7032-10UN | purified flavoenzyme |
| alpha-ketoglutarate dehydrogenase complex | SIGMA | K1502-20UN | purified flavoenzyme |
| 30% hydrogen peroxide solution | SIGMA | HX0640-5 | reagent, standard curves |
| NAD+ | SIGMA | N0632-1G | reagent, activity/ROS release assay |
| NADH | SIGMA | N4505-100MG | reagent, standard curves |
| pyruvate | SIGMA | P2256-5G | reagent, activity/ROS release assay |
| alpha-ketoglutarate | SIGMA | 75892-25G | reagent, activity/ROS release assay |
| CoASH | SIGMA | C3019-25MG | reagent, activity/ROS release assay |
| thiamine pyrophosphate | SIGMA | C8754-1G | reagent, activity/ROS release assay |
| mannitol | SIGMA | M4125-100G | buffer component |
| Hepes | SIGMA | H3375-25G | buffer component |
| sucrose | SIGMA | S7903-250G | buffer component |
| EGTA | SIGMA | E3889-10G | buffer component |
| KMV | SIGMA | 198978-5G | reagent, ROS release inhibitor |
| CPI-613 | Santa Cruz | sc-482709 | reagent, ROS release inhibitor |
| SOD | SIGMA | S9697-15KU | reagent, ROS release detection |
| horseradish peroxidase | SIGMA | P8375-1KU | reagent, ROS release detection |
| Amplex Ultra Red | Thermofisher | A36006 | reagent, ROS release detection |
| Biotech Synergy 2 microplate reader | BioTek Instruments | microplate reader for assays | |
| Gen5 software | BioTek Instruments | software, used for collection of raw RFU | |
| Graphpad Prism | Graphpad software | software, data analysis | |
| Microsoft EXCEL | Microsoft | software, data analysis |
References
- Mailloux, R. J. Teaching the fundamentals of electron transfer reactions in mitochondria and the production and detection of reactive oxygen species. Redox Biol. 4, 381-398 (2015).
- Nicholls, D. G. Forty years of Mitchell’s proton circuit: From little grey books to little grey cells. Biochim Biophys Acta. 1777 (7-8), 550-556 (2008).
- Brand, M. D. Mitochondrial generation of superoxide and hydrogen peroxide as the source of mitochondrial redox signaling. Free Radic Biol Med. 100, 14-31 (2016).
- Massey, V. Activation of molecular oxygen by flavins and flavoproteins. J Biol Chem. 269 (36), 22459-22462 (1994).
- Mailloux, R. J., Gardiner, D., O’Brien, M. 2-Oxoglutarate dehydrogenase is a more significant source of O2(.-)/H2O2 than pyruvate dehydrogenase in cardiac and liver tissue. Free Radic Biol Med. 97, 501-512 (2016).
- Sies, H., Berndt, C., Jones, D. P. Oxidative Stress. Annu Rev Biochem. 86, 715-748 (2017).
- Kuksal, N., Chalker, J., Mailloux, R. J. Review. Progress in understanding the molecular oxygen paradox – function of mitochondrial reactive oxygen species in cell signaling. Biol Chem. , (2017).
- Murphy, M. P. How mitochondria produce reactive oxygen species. Biochem J. 417 (1), 1-13 (2009).
- Wong, H. S., Dighe, P. A., Mezera, V., Monternier, P. A., Brand, M. D. Production of superoxide and hydrogen peroxide from specific mitochondrial sites under different bioenergetic conditions. J Biol Chem. , (2017).
- Harper, M. E., Green, K., Brand, M. D. The efficiency of cellular energy transduction and its implications for obesity. Annu Rev Nutr. 28, 13-33 (2008).
- Ambrus, A., et al. Formation of reactive oxygen species by human and bacterial pyruvate and 2-oxoglutarate dehydrogenase multienzyme complexes reconstituted from recombinant components. Free Radic Biol Med. 89, 642-650 (2015).
- Tretter, L., Adam-Vizi, V. Generation of reactive oxygen species in the reaction catalyzed by alpha-ketoglutarate dehydrogenase. J Neurosci. 24 (36), 7771-7778 (2004).
- Slade, L., et al. Examination of the superoxide/hydrogen peroxide forming and quenching potential of mouse liver mitochondria. Biochim Biophys Acta. 1861 (8), 1960-1969 (2017).
- O’Brien, M., Chalker, J., Slade, L., Gardiner, D., Mailloux, R. J. Protein S-glutathionylation alters superoxide/hydrogen peroxide emission from pyruvate dehydrogenase complex. Free Radic Biol Med. 106, 302-314 (2017).
- Quinlan, C. L., et al. The 2-oxoacid dehydrogenase complexes in mitochondria can produce superoxide/hydrogen peroxide at much higher rates than complex I. J Biol Chem. 289 (12), 8312-8325 (2014).
- Mailloux, R. J., Craig Ayre, D., Christian, S. L. Induction of mitochondrial reactive oxygen species production by GSH mediated S-glutathionylation of 2-oxoglutarate dehydrogenase. Redox Biol. 8, 285-297 (2016).
- Mailloux, R. J., Gardiner, D., O’Brien, M. 2-Oxoglutarate dehydrogenase is a more significant source of O2(.-)/H2O2 than pyruvate dehydrogenase in cardiac and liver tissue. Free Radic Biol Med. 97, 501-512 (2016).
- Ambrus, A., Adam-Vizi, V. Human dihydrolipoamide dehydrogenase (E3) deficiency: Novel insights into the structural basis and molecular pathomechanism. Neurochem Int. , (2017).
- Young, A., Gardiner, D., Brosnan, M. E., Brosnan, J. T., Mailloux, R. J. Physiological levels of formate activate mitochondrial superoxide/hydrogen peroxide release from mouse liver mitochondria. FEBS Lett. 591 (16), 2426-2438 (2017).
- Fisher-Wellman, K. H., et al. Mitochondrial glutathione depletion reveals a novel role for the pyruvate dehydrogenase complex as a key H2O2-emitting source under conditions of nutrient overload. Free Radic Biol Med. 65, 1201-1208 (2013).
- Kussmaul, L., Hirst, J. The mechanism of superoxide production by NADH:ubiquinone oxidoreductase (complex I) from bovine heart mitochondria. Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (20), 7607-7612 (2006).
- Huang, L. S., Borders, T. M., Shen, J. T., Wang, C. J., Berry, E. A. Crystallization of mitochondrial respiratory complex II from chicken heart: a membrane-protein complex diffracting to 2.0. A. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 61 (Pt 4), 380-387 (2005).
- Yeh, J. I., Chinte, U., Du, S. Structure of glycerol-3-phosphate dehydrogenase, an essential monotopic membrane enzyme involved in respiration and metabolism. Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (9), 3280-3285 (2008).
