फ्लेविन-युक्त Mitochondrial Dehydrogenases द्वारा सुपरऑक्साइड/हाइड्रोजन पेरोक्साइड और नध उत्पादन का एक साथ मापन
Summary
Mitochondria कई फ्लेविन निर्भर एंजाइमों कि प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियों (ROS) का उत्पादन कर सकते होते हैं । mitochondria में व्यक्तिगत साइटों से ROS जारी निगरानी अवांछित पक्ष प्रतिक्रियाओं के कारण चुनौतीपूर्ण है । हम शुद्ध flavoenzymes और microplate fluorometry का उपयोग ROS रिहाई के लिए देशी दरों के प्रत्यक्ष मूल्यांकन के लिए एक आसान, सस्ती विधि पेश करते हैं ।
Abstract
यह बताया गया है कि mitochondria प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियों (ROS) के 12 एंजाइमी स्रोतों को शामिल कर सकते हैं । इन साइटों के बहुमत फ्लेविन निर्भर श्वसन परिसरों और dehydrogenases कि सुपरऑक्साइड (ओ2●-) और हाइड्रोजन पेरोक्साइड (एच2ओ2) का एक मिश्रण का उत्पादन शामिल हैं । अलग mitochondria में व्यक्तिगत साइटों की ROS उत्पादन क्षमता का सटीक ठहराव एंटीऑक्सीडेंट रक्षा प्रणालियों और पक्ष प्रतिक्रियाओं की उपस्थिति के कारण चुनौतीपूर्ण हो सकता है कि यह भी रूप में2●-/H2o2. mitochondrial को बाधित कर सकते हैं कि विशिष्ट अवरोधकों का उपयोग भी उत्पादन के अन्य साइटों से ROS रिहाई में फेरबदल करके माप समझौता कर सकते हैं. यहां, हम एच2ओ2 रिलीज और nicotinamide adenine dinucleotide (नध) के उत्पादन के एक साथ माप के लिए एक आसान तरीका शुद्ध फ्लेविन-लिंक्ड dehydrogenases द्वारा प्रस्तुत करते हैं । हमारे यहाँ प्रयोजनों के लिए, हम उदाहरण के रूप में ketoglutarate हृदय उत्पत्ति के शुद्ध पाइरूवेट डिहाइड्रोजनेज परिसर (PDHC) और α-डिहाइड्रोजनेज KGDHC परिसर (सुअर का) का उपयोग किया है. इस विधि ROS और एंटीऑक्सीडेंट सिस्टम के अंय संभावित स्रोतों को नष्ट करने के उत्पादन के व्यक्तिगत साइटों द्वारा देशी एच2हे2 रिलीज दरों के एक सटीक उपाय के लिए अनुमति देता है । इसके अलावा, इस विधि एच2हे2 रिलीज और एंजाइम गतिविधि और प्रभावशीलता और ROS उत्पादन के लिए अवरोधकों के selectivity की स्क्रीनिंग के बीच संबंधों की एक सीधी तुलना के लिए अनुमति देता है । कुल मिलाकर, इस दृष्टिकोण अलग mitochondria या permeabilized मांसपेशी फाइबर के साथ और अधिक परिष्कृत प्रयोगों के संचालन से पहले व्यक्तिगत एंजाइमों के लिए ROS रिहाई की देशी दरों की गहराई से मूल्यांकन के लिए अनुमति दे सकते हैं.
Introduction
पोषक चयापचय का अंतिम लक्ष्य adenosine ट्राइफॉस्फेट (एटीपी) बनाना है । स्तनधारी कोशिकाओं में, यह mitochondria में होता है, डबल-झिल्ली organelles है कि ऊर्जा में परिवर्तित एटीपी में कार्बन संग्रहीत । एटीपी का उत्पादन तब शुरू होता है जब कार्बन दो इलेक्ट्रॉनक वाहक, नध और फ्लेविन adenine dinucleotide (फॊध२)१के गठन mitochondria द्वारा combusted जाता है. नध और फॊध2 तो बहु-उप इकाई श्वसन परिसरों मैं और द्वितीय क्रमशः, और मुक्त इलेक्ट्रॉनों परिसर में चतुर्थ1पर टर्मिनल इलेक्ट्रॉन स्वीकारकर्ता आणविक ऑक्सीजन (ओ2) ferried कर रहे है द्वारा ऑक्सीकरण हो जाता है । इस श्रृंखला के अंत में के लिए इलेक्ट्रॉनों के “ढलान” डाउनहिल हस्तांतरण के लिए2 ओ, मैं, III, और चतुर्थ जटिल द्वारा झिल्ली अंतरिक्ष में प्रोटान के निर्यात के लिए युग्मित है । यह प्रोटान के एक transmembrane विद्युत ढाल बनाता है (प्रोटॉन-मकसद बल), गिब्स मुक्त ऊर्जा है कि जटिल वी द्वारा उपयोग के लिए एटीपी2बनाने के लिए एक अस्थाई रूप । mitochondria में इलेक्ट्रॉन हस्तांतरण प्रतिक्रियाओं पूरी तरह से एटीपी उत्पादन के लिए युग्मित नहीं कर रहे हैं । Krebs चक्र और श्वसन श्रृंखला में विभिन्न बिंदुओं पर, इलेक्ट्रॉनों समय से पहले ROS3फार्म करने के लिए हे2 के साथ बातचीत कर सकते हैं । mitochondria द्वारा सृजित सबसे जैविक रूप से प्रासंगिक ROS ओ2●- और एच2ओ2हैं । हालांकि ओ2●- अक्सर mitochondria द्वारा गठित समीपस्थ ROS माना जाता है, यह अब स्पष्ट है कि उत्पादन की साइटों ओ2●- और एच2ओ2का एक मिश्रण है, जो मुक्त के साथ जुड़ा हुआ है के रूप में फ्लेविन बनाव समूहों के कट्टरपंथी रसायन विज्ञान4,5। उच्च स्तर पर, ROS खतरनाक हो सकता है, ऑक्सीडेटिव संकट में जिसके परिणामस्वरूप सेल समारोह के लिए आवश्यक हानिकारक जैविक घटकों6। हालांकि, कम मात्रा में, mitochondrial ROS महत्वपूर्ण संकेतन कार्यों को पूरा । उदाहरण के लिए, एच2ओ2 रिलीज mitochondria से टी सेल सक्रियण, तनाव सिग्नलिंग (जैसे, Nrf2 संकेतन रास्ते की प्रेरण) को नियंत्रित करने में फंसाया गया है, सेल प्रसार और भेदभाव की प्रेरण, इंसुलिन संकेतन और रिलीज, और खिला व्यवहार7. काफी प्रगति ROS के संकेतन समारोह को समझने में किया गया है । हालांकि, महत्वपूर्ण सवाल अभी भी संबंध में जो mitochondria में एंजाइमों सबसे महत्वपूर्ण स्रोतों और कैसे उत्पादन नियंत्रित किया जाता है के रूप में काम करते रहते हैं ।
उत्पादन की एक साइट द्वारा ROS रिलीज कई कारकों पर निर्भर करता है: 1) इलेक्ट्रॉन दान साइट की एकाग्रता, 2) साइट दान इलेक्ट्रॉन के redox राज्य, 3) ऑक्सीजन के लिए उपयोग, और 4) एकाग्रता और ऑक्सीकरण सब्सट्रेट के प्रकार3, 8 , ९. mitochondria में, नध की एकाग्रता और झिल्ली संभावित ताकत जैसे अन्य कारक भी ROS उत्पादन८,१०को प्रभावित करते हैं. उदाहरण के लिए, o2की दर●-/H2o2 उत्पादन को शुद्ध PDHC या KGDHC के द्वारा बढ़ाने नध की उपलब्धता5,11के साथ बढ़ जाती है । इस परिदृश्य में, इलेक्ट्रॉनों नध से पीछे की तरफ बह रहे है सनक केंद्र में PDHC या KGDHC के ई3 उप इकाई, o2के लिए साइट●-/H2हे2 उत्पादन12। इसी प्रकार, णड+ के प्रावधान पर विपरीत प्रभाव पड़ता है, ROS KGDHC12से घट रही है । इस प्रकार, प्रवेश या ROS उत्पादन की साइटों से इलेक्ट्रॉनों के निकास को नियंत्रित कितना हे2●-/H2ओ2 गठन बदल सकते हैं । उदाहरण के लिए, सीपीआई-६१३, एक लाइपो एसिड अनुरूप, के साथ PDHC या KGDHC के ई2 उप इकाई को अवरुद्ध2ओ में लगभग ९०% कमी में परिणाम●-/H2हे2 उत्पादन13। इसी तरह के परिणाम रासायनिक एस-glutathionylation उत्प्रेरक, diamide और disulfiram के साथ प्राप्त किया जा सकता है, जो लगभग समाप्त हे2●-/H2o2 उत्पादन द्वारा PDHC या KGDHC द्वारा विकार के glutathione के माध्यम से ई 2 उपइकाई14. PDHC और KGDHC के ई२ उपइकाई के माध्यम से इलेक्ट्रॉनक प्रवाह को अवरुद्ध करने के लए व्यापार बंद नध उत्पादन में कमी आती है जो इलेक्ट्रॉनक परिवहन श्रृंखला (उदा., कॉम्प्लेक्स III) द्वारा ROS गठन को घटता है. यह भी इलेक्ट्रॉन परिवहन श्रृंखला द्वारा एटीपी उत्पादन में कमी कर सकते हैं । कुल मिलाकर, ROS उत्पादन की साइटों को अवरुद्ध इलेक्ट्रॉन प्रविष्टि ओ2●-/H2ओ2 उत्पादन को नियंत्रित करने का एक बहुत प्रभावी साधन हो सकता है ।
Mitochondria 12 क्षमता ओ2●-/H2ओ2 सूत्रों6शामिल कर सकते हैं । इन साइटों के अधिकांश फ्लेविन-एंजाइमों जो ओ2●- और एच2ओ2का एक मिश्रण उत्पंन युक्त हैं । विभिंन सब्सट्रेट और अवरोधक संयोजनों के उपयोग की पहचान के लिए अनुमति दी है जो श्वसन परिसरों और mitochondrial dehydrogenases उच्च क्षमता के रूप में सेवा ओ2●-/H2ओ2 बनाने साइटों में विभिंन ऊतकों3। PDHC और KGDHC उच्च क्षमता ओ2●-/H2ओ2 मांसपेशी और जिगर mitochondria13,15में उत्सर्जक साइटों के रूप में सेवा करने के लिए दिखाया गया है । हालांकि, कुछ कठिनाइयों की परीक्षा के संबंध में रहना हे2●-/H2o2 mitochondria में व्यक्तिगत साइटों के बनाने की क्षमता और प्रभाव है कि विभिन्न सब्सट्रेट और अवरोधक संयोजन पर है एंजाइमों की गतिविधियों । यह अवांछित पक्ष प्रतिक्रियाओं की उपस्थिति के कारण है (जैसे, ओ2के गठन●-/H2हे2 ब्याज के एंजाइम के अलावा अन्य साइटों द्वारा), अंतर्जात पोषक तत्वों को दूषित (जैसे,फैटी एसिड) या organelles (जैसे, peroxisomes जो भी रूप ओ2●-/H2हे2), और अवरोधकों का उपयोग करें कि कमी selectivity, और/या यौगिकों कि पूरी तरह से ROS उत्पादन को बाधित नहीं का उपयोग करें । कुछ अवरोधकों को भी mitochondrialता और इलेक्ट्रॉन प्रवाह की दिशा में परिवर्तन कर सकते हैं, और यह उत्पादन के अंय साइटों से ROS रिलीज बदल और पाया परिणाम । के लिए निरपेक्ष दरों ओ2●-/H2ओ2 रिलीज mitochondria में व्यक्तिगत साइटों से भी मुश्किल हो जाता है की उच्च एकाग्रता की वजह से हे2●- और एच2ओ2 मैट्रिक्स और झिल्ली अंतरिक्ष में एंजाइमों को नष्ट करने. इसलिए, किसी भी प्रतिस्पर्धा प्रतिक्रियाओं कि ओ2●-/H2o2 रिलीज माप के साथ हस्तक्षेप कर सकते हैं के उन्मूलन उपयोगी हो सकता है जब उच्च क्षमता की पहचान हे2●-/H2हे2 बनाने साइटें ।
यहां, हम एक सरल तरीका है कि ओ2के एक साथ परीक्षा के लिए अनुमति देता है●-/H2o2 उत्पादन और नध गठन शुद्ध फ्लेविन-निर्भर dehydrogenases द्वारा प्रस्तुत करते हैं । शुद्ध एंजाइमों, अवांछित ROS बनाने पक्ष प्रतिक्रियाओं और ROS अपमानजनक एंजाइमों का उपयोग करके देशी हे2●-/H2ओ2 उत्पादन दर के लिए व्यक्तिगत flavoenzymes के एक अधिक सटीक उपाय के लिए अनुमति समाप्त किया जा सकता है । इस विधि से सीधे ओ2●-/H2ओ2 अलग शुद्ध dehydrogenases के बनाने की क्षमता की तुलना करने के लिए या संभावित साइट के लिए विशेष अवरोधकों स्क्रीन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता हे2●-/H2ओ 2 रिलीज । अंत में, मापने ओ2●-/H2o2 और नध उत्पादन एक साथ एंजाइम गतिविधि और ROS रिलीज क्षमता के बीच संबंधों के एक वास्तविक समय मूल्यांकन के लिए अनुमति दे सकते हैं ।
Protocol
Representative Results
Discussion
इस प्रोटोकॉल के बाद से लाभप्रद है, 1) यह किसी भी प्रतिस्पर्धा प्रतिक्रियाओं कि अंयथा एच2O2 का पता लगाने (जैसे, एंटीऑक्सीडेंट सिस्टम या ROS के अंय स्रोतों) के साथ हस्तक्षेप कर सकते है समाप्त, 2) की मू…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
यह काम प्राकृतिक विज्ञान और इंजीनियरिंग रिसर्च काउंसिल ऑफ कनाडा (NSERC) द्वारा वित्त पोषित किया गया । वीडियो उत्पादन में नवाचार के लिए केंद्र के सहयोग से किया गया शिक्षण और अधिगम में (CITL) मेमोरियल विश्वविद्यालय में Newfoundland ।
Materials
| Pyruvate dehydrogenase complex | SIGMA | P7032-10UN | purified flavoenzyme |
| alpha-ketoglutarate dehydrogenase complex | SIGMA | K1502-20UN | purified flavoenzyme |
| 30% hydrogen peroxide solution | SIGMA | HX0640-5 | reagent, standard curves |
| NAD+ | SIGMA | N0632-1G | reagent, activity/ROS release assay |
| NADH | SIGMA | N4505-100MG | reagent, standard curves |
| pyruvate | SIGMA | P2256-5G | reagent, activity/ROS release assay |
| alpha-ketoglutarate | SIGMA | 75892-25G | reagent, activity/ROS release assay |
| CoASH | SIGMA | C3019-25MG | reagent, activity/ROS release assay |
| thiamine pyrophosphate | SIGMA | C8754-1G | reagent, activity/ROS release assay |
| mannitol | SIGMA | M4125-100G | buffer component |
| Hepes | SIGMA | H3375-25G | buffer component |
| sucrose | SIGMA | S7903-250G | buffer component |
| EGTA | SIGMA | E3889-10G | buffer component |
| KMV | SIGMA | 198978-5G | reagent, ROS release inhibitor |
| CPI-613 | Santa Cruz | sc-482709 | reagent, ROS release inhibitor |
| SOD | SIGMA | S9697-15KU | reagent, ROS release detection |
| horseradish peroxidase | SIGMA | P8375-1KU | reagent, ROS release detection |
| Amplex Ultra Red | Thermofisher | A36006 | reagent, ROS release detection |
| Biotech Synergy 2 microplate reader | BioTek Instruments | microplate reader for assays | |
| Gen5 software | BioTek Instruments | software, used for collection of raw RFU | |
| Graphpad Prism | Graphpad software | software, data analysis | |
| Microsoft EXCEL | Microsoft | software, data analysis |
References
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