Twee-foton Intravital Imaging van leukocyten tijdens de immuunrespons bij Lipopolysaccharide-behandelde muis lever
Summary
We een nieuwe chirurgische protocol voor twee-foton beeldvorming van levende muizen lever met minimale invasie opgericht. Met deze techniek vastgesteld we de gedetailleerde structuur van de lever tijdens lipopolysaccharide-geïnduceerde endotoxemia. Wij verwachten dat deze methode kan worden gebruikt om te bepalen van de effectiviteit van verschillende behandeling van de reagentia te hepatische migratie.
Abstract
Sepsis is een soort ernstige infectie die orgaanfalen en weefsel kan veroorzaken schade. Hoewel de tarieven van de mortaliteit en morbiditeit geassocieerd met sepsis zijn extreem hoog, geen directe behandeling of orgel-gerelateerde mechanisme is onderzocht in detail in real-time. De lever is het belangrijkste orgaan, die worden beheerd met toxines en infecties in het menselijk lichaam. Hierin wilde we intravital beeldvorming van muis lever na inductie van endotoxemia uitvoeren om het bijhouden van de beweeglijkheid van immune cellen, zoals neutrofielen en lever kapselvorming macrofagen (LCMs). Dienovereenkomstig, we ontwierpen een nieuwe chirurgische methode voor blootstelling van de lever met minimaal invasieve chirurgie. Muizen werden intraperitoneally met lipopolysaccharide (LPS), een gemeenschappelijke endotoxine ingespoten. Met behulp van onze nieuwe chirurgische benadering voor blootstelling en intravital beeldvorming van de muis lever, dat we vonden dat neutrofiele aanwerving in LPS-behandeld LysM-groen fluorescente proteïne (GFP) werd muis lever verhoogd in vergelijking met die in fosfaatgebufferde Saline-behandelde lever. Na de behandeling van de LP’s, het aantal neutrofielen aanzienlijk gestegen met tijd. Bovendien, met behulp van CX3Cr1-GFP muizen, we met succes lever resident macrofagen genaamd LCMs gevisualiseerd. Daarom voor het onderzoek naar de werkzaamheid van nieuwe reagentia te controleren immuun mobiliteit in vivo, kan vaststelling van de motiliteit en morfologie van neutrofielen en LCMs in de lever toestaan ons te identificeren therapeutisch effect in orgel falen en weefsel schade veroorzaakt door de activering van de leukocyten in sepsis.
Introduction
De lever is het grootste metabole orgaan in zoogdieren; het fungeert als een verkeerstoren voor energie, hormonen en ontgifting1. Vanwege het belang ervan, hebben de onderzoekers vele in vitro en in vivo experimenten om het verhelderen van de wijzigingen in de lever tijdens ontsteking uitgevoerd. Intravital microscopie is gebruikt om live beelden van de lever2 te vangen. Inderdaad, introduceerde diverse lever beeldvormende methoden zijn2,3,,4,,5,6. Echter om een eenvoudigere chirurgische aanpak ontwikkelen en stabilisatie van de doel-orgel en de immuuncellen te bereiken, ontwierpen we een eenvoudige protocol dat onderzoekers om te minimaliseren van hun inspanningen voor intravital imaging kan begeleiden.
In deze studie introduceerde wij een stabiel en roman imaging kamer en chirurgische techniek die gebruikt kan worden om te minimaliseren van bloeden en mogelijke infecties. We hebben bevestigd dat de lever bleef intact gedurende meer dan 2 uur. Met deze methode vastgesteld we met succes morphologies van LCMs7 en neutrofielen onder septische voorwaarde. Aangezien deze methode storende factoren van fysische en biologische zoals beven en onverwachte ontsteking tijdens chirurgische ingreep minimaliseert, verwachten wij dat deze methode kan worden gebruikt om het observeren van acute reacties van immune cellen in de lever in reactie op reagentia zoals LPS.
Protocol
Representative Results
Discussion
De lever is actief bestudeerd door vele groepen3,10, vanwege het belang van zijn functie. Bijvoorbeeld, stelde Heymann et al. een gevoelige methode met behulp van agarose. Hoewel deze methode bleek te zijn zeer nauwkeurige, heeft de instelling van de agarose duurt. Echter, met onze methodologie alle procedures kunnen worden uitgevoerd binnen 30 min, minimaliseren van andere storende factoren. Ten tweede, het stabiliseren van de lever is zeer belangrijk omdat de h…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Deze studie werd gesteund door een subsidie van de nationale onderzoek Stichting van Korea (NRF) gefinancierd door de regering van Korea (MSIP; subsidie no. 2016R1A2B4008199 tot Y-M. H.), en het ministerie van volksgezondheid en welzijn, Republiek Korea (verlenen van nummer: HI14C1324).
Materials
| Custom designed chamber | Live Cell Instruments | Custom-designed size | |
| Metal cover slide | Live Cell Instruments | Custom-designed size | |
| Cover glass | Electron Microscopy Sciences | #72204-03 | |
| Sylgard 184 Silicone elastomer kit | Dow Corning | ||
| Erlenmeyer flask | DURAN | 21 216 36 | |
| Cell culture plate (Flat type) | HYUNDAI Micro Co. | H31006 | |
| Desiccator | ADARSH | 55204 | |
| High Q BOND SE 5 mL | BJM LAB | To make semi-permanent dam | |
| Flexible Silicone Rubber Heaters | Omega | SRFR/SRFG SERIES, M1250/0800 | |
| DC power supply | Toyotech | DP30-03A | |
| Phosphate-buffered saline | Home-made | ||
| Lipopolysaccharides (LPS) from Salmonella enteria serotype enteritidis | Sigma-Aldrich | L6011 | |
| Texas Red Dextran | Thermo Fisher Scientific | D1830 | |
| 15 mL High-clarity polypropylene conical tube |
FALCON | 14-959-49B | |
| 0.45 μm filter (Minisart Syringe Filter) | Sartorius | 16555k | |
| 1.5ml Micro Tube, Amber | Axygen | MCT-150-X | For light-blocking |
| 1 mL syringe | Korea Vaccine | KV-S01 | |
| 3 mL syringe | Korea Vaccine | KV-S03 | |
| 10 mL syringe | Korea Vaccine | KV-S10 | |
| 0.3 mL insulin syringe | Becton Dickinson | 324900 | |
| Hair removal cream 100 mL | Body natur | ||
| Cotton swab | ABDI | ||
| Zoletil 50 5 mL | Virbac | ||
| Rompun 10 mL | Bayer | ||
| Heating plate | Live Cell Instruments | PH-S-10 | Custom-designed size |
| DC controller | Live Cell Instruments | CU-301 | |
| Microdessection Scissors | Harvard Apparatus | 72-5418 | |
| Scissors | Roboz | RS-5882 | |
| Forceps | Roboz | RS-5137 | |
| Vet bond | 3M | 1469SB | |
| ZEN software (Black Edition) | Carl Zeiss | Program for LSM 7 MP | |
| LSM 7 MP | Carl Zeiss | ||
| Volocity | PerkinElmer | Analysis program |
References
- Girard, J. R., et al. Fuels, hormones, and liver metabolism at term and during the early postnatal period in the rat. J Clin Invest. 52 (12), 3190-3200 (1973).
- Marques, P. E., et al. Imaging liver biology in vivo using conventional confocal microscopy. Nat Protoc. 10 (2), 258-268 (2015).
- Dasari, S., Weber, P., Makhloufi, C., Lopez, E., Forestier, C. L. Intravital Microscopy Imaging of the Liver following Leishmania Infection: An Assessment of Hepatic Hemodynamics. J Vis Exp. (101), e52303 (2015).
- Honda, M., et al. Intravital imaging of neutrophil recruitment in hepatic ischemia-reperfusion injury in mice. Transplantation. 95 (4), 551-558 (2013).
- Jenne, C. N., Wong, C. H., Petri, B., Kubes, P. The use of spinning-disk confocal microscopy for the intravital analysis of platelet dynamics in response to systemic and local inflammation. PLoS One. 6 (9), e25109 (2011).
- Ritsma, L., et al. Intravital microscopy through an abdominal imaging window reveals a pre-micrometastasis stage during liver metastasis. Sci Transl Med. 4 (158), 158ra145 (2012).
- Sierro, F., et al. A Liver Capsular Network of Monocyte-Derived Macrophages Restricts Hepatic Dissemination of Intraperitoneal Bacteria by Neutrophil Recruitment. Immunity. 47 (2), 374-388 (2017).
- Faust, N., Varas, F., Kelly, L. M., Heck, S., Graf, T. Insertion of enhanced green fluorescent protein into the lysozyme gene creates mice with green fluorescent granulocytes and macrophages. Blood. 96 (2), 719-726 (2000).
- Jung, S., et al. Analysis of fractalkine receptor CX(3)CR1 function by targeted deletion and green fluorescent protein reporter gene insertion. Mol Cell Biol. 20 (11), 4106-4114 (2000).
- Heymann, F., et al. Long term intravital multiphoton microscopy imaging of immune cells in healthy and diseased liver using CXCR6.Gfp reporter mice. J Vis Exp. (97), (2015).
