שני הפוטונים הדמיה Intravital של לויקוציטים במהלך התגובה החיסונית בכבד עכבר שטופלו ליפופוליסכריד
Summary
הקמנו פרוטוקול כירורגיים חדשניים עבור שני הפוטונים הדמיה של עכברים חיים כבד עם הפלישה מינימלי. בטכניקה זו, זיהינו את מבנה נתונים היסטוריים של הכבד במהלך endotoxemia ליפופוליסכריד-induced. אנו צופים כי שיטה זו עשויה להיות מנוצל כדי לקבוע את היעילות של טיפול שונים ריאגנטים ליקוציט הכבד ההעברה.
Abstract
אלח דם הוא סוג של זיהום חמור העלולה לגרום לכשל איברים ורקמות נזק. למרות שיעור תמותה ותחלואה קרדיווסקולרית המשויך אלח דם גבוהה מאוד, לא ישירה טיפול או מנגנון הקשורות איברים נבדקה בפירוט בזמן אמת. הכבד הוא האיבר מפתח שמנהל רעלים וזיהומים בגוף האדם. במסמך זה, כיוונו לבצע הדמיה intravital של העכבר הכבד לאחר אינדוקציה של endotoxemia כדי לעקוב אחר על תנועתיות של תאים חיסוניים, כגון נויטרופילים ומקרופגים דרכים הכבד (LCMs). בהתאם לכך, תיכננו שיטה כירורגית לחשיפה של הכבד עם כירורגיה זעיר פולשנית. עכברים הוזרקו intraperitoneally ליפופוליסכריד (LPS), אנדוטוקסין נפוצות. באמצעות הגישה כירורגי הרומן שלנו עבור חשיפה intravital הדמיה של גיוס העכבר כבד, שמצאנו כי נויטרופילים בחלבון פלואורסצנטי LPS שטופלו LysM-ירוק (GFP) העכבר הכבד היה גדל לעומת זאת, באגירה פוספט הכבד שטופלו תמיסת מלח. לאחר הטיפול LPS, המספר של נויטרופילים גדל באופן משמעותי עם הזמן. בנוסף, שימוש בעכברים CX3Cr1-GFP, אנחנו בהצלחה דמיינו הכבד מקרופאגים תושב בשם איכות המזון. לכן, כדי לחקור את היעילות של ריאגנטים חדש כדי לשלוט ניידות המערכת החיסונית ויוו, קביעת תנועתיות של המורפולוגיה של נויטרופילים ו- LCMs בכבד עשוי לאפשר לנו לזהות את האפקט הטיפולי של האיבר כשל ורקמות הנזק שנגרם על ידי הפעלת לויקוציטים באלח דם.
Introduction
הכבד הוא האיבר חילוף החומרים העיקריים אצל יונקים; היא פועלת כמו מגדל פיקוח עבור אנרגיה, הורמונים, ניקוי רעלים1. בשל חשיבותה, חוקרים ניהלו ניסויים במבחנה , ויוו רבים התירי את השינויים בכבד בעת דלקת. מיקרוסקופ intravital שימש כדי ללכוד תמונות בשידור חי כבד2 . אכן, הכבד שונים בשיטות הדמיה כבר הציגה2,3,4,5,6. עם זאת, על מנת לפתח בגישה כירורגית פשוטה יותר ולהשיג ייצוב של איבר המטרה של תאים חיסוניים, תיכננו את פרוטוקול פשוט יכול להנחות חוקרים כדי לצמצם את המאמץ שלהם עבור הדמיה intravital.
במחקר זה, הצגנו קאמרית הדמיה הרומן ויציבה בעלת טכניקה כירורגית שניתן להשתמש בו כדי למזער זיהומים דימומים וסיבוכים אפשריים. וידאנו בכבד נשארה במשך יותר מ 2 h… בשיטה זו, זיהינו בהצלחה מורפולוגיות של איכות המזון7 ו נויטרופילים בתנאי ספיגה. מאז בשיטה זו ממזערת פיזי וביולוגי גורמים מבלבלים כגון דלקת בלתי צפוי ורועדת במהלך הליך כירורגי, אנו צופים כי ניתן להשתמש בשיטה זו כדי לבחון תופעות חריפה של תאים חיסוניים בכבד בתגובה ריאגנטים כמו LPS.
Protocol
Representative Results
Discussion
הכבד נחקרה באופן פעיל על ידי הרבה קבוצות3,10, בשל חשיבות תפקודה. למשל, היימן ואח הציע שיטה עדינה באמצעות agarose. למרות ששיטה זו נמצאה להיות מדויק מאוד, ההגדרה agarose לוקח זמן. עם זאת, עם המתודולוגיה שלנו, כל ההליכים יכול להתבצע בתוך 30 דקות, צמצום גורמים אחרים מבלבלים….
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
מחקר זה נתמך על ידי מענק של נבחרת מחקר קרן של קוריאה (ב- NRF) ממומן על ידי ממשלת קוריאה (MSIP; מענק מס 2016R1A2B4008199 Y-מ’. ח’), ו משרד הבריאות & רווחה, הרפובליקה של קוריאה (להעניק את המספר: HI14C1324).
Materials
| Custom designed chamber | Live Cell Instruments | Custom-designed size | |
| Metal cover slide | Live Cell Instruments | Custom-designed size | |
| Cover glass | Electron Microscopy Sciences | #72204-03 | |
| Sylgard 184 Silicone elastomer kit | Dow Corning | ||
| Erlenmeyer flask | DURAN | 21 216 36 | |
| Cell culture plate (Flat type) | HYUNDAI Micro Co. | H31006 | |
| Desiccator | ADARSH | 55204 | |
| High Q BOND SE 5 mL | BJM LAB | To make semi-permanent dam | |
| Flexible Silicone Rubber Heaters | Omega | SRFR/SRFG SERIES, M1250/0800 | |
| DC power supply | Toyotech | DP30-03A | |
| Phosphate-buffered saline | Home-made | ||
| Lipopolysaccharides (LPS) from Salmonella enteria serotype enteritidis | Sigma-Aldrich | L6011 | |
| Texas Red Dextran | Thermo Fisher Scientific | D1830 | |
| 15 mL High-clarity polypropylene conical tube |
FALCON | 14-959-49B | |
| 0.45 μm filter (Minisart Syringe Filter) | Sartorius | 16555k | |
| 1.5ml Micro Tube, Amber | Axygen | MCT-150-X | For light-blocking |
| 1 mL syringe | Korea Vaccine | KV-S01 | |
| 3 mL syringe | Korea Vaccine | KV-S03 | |
| 10 mL syringe | Korea Vaccine | KV-S10 | |
| 0.3 mL insulin syringe | Becton Dickinson | 324900 | |
| Hair removal cream 100 mL | Body natur | ||
| Cotton swab | ABDI | ||
| Zoletil 50 5 mL | Virbac | ||
| Rompun 10 mL | Bayer | ||
| Heating plate | Live Cell Instruments | PH-S-10 | Custom-designed size |
| DC controller | Live Cell Instruments | CU-301 | |
| Microdessection Scissors | Harvard Apparatus | 72-5418 | |
| Scissors | Roboz | RS-5882 | |
| Forceps | Roboz | RS-5137 | |
| Vet bond | 3M | 1469SB | |
| ZEN software (Black Edition) | Carl Zeiss | Program for LSM 7 MP | |
| LSM 7 MP | Carl Zeiss | ||
| Volocity | PerkinElmer | Analysis program |
References
- Girard, J. R., et al. Fuels, hormones, and liver metabolism at term and during the early postnatal period in the rat. J Clin Invest. 52 (12), 3190-3200 (1973).
- Marques, P. E., et al. Imaging liver biology in vivo using conventional confocal microscopy. Nat Protoc. 10 (2), 258-268 (2015).
- Dasari, S., Weber, P., Makhloufi, C., Lopez, E., Forestier, C. L. Intravital Microscopy Imaging of the Liver following Leishmania Infection: An Assessment of Hepatic Hemodynamics. J Vis Exp. (101), e52303 (2015).
- Honda, M., et al. Intravital imaging of neutrophil recruitment in hepatic ischemia-reperfusion injury in mice. Transplantation. 95 (4), 551-558 (2013).
- Jenne, C. N., Wong, C. H., Petri, B., Kubes, P. The use of spinning-disk confocal microscopy for the intravital analysis of platelet dynamics in response to systemic and local inflammation. PLoS One. 6 (9), e25109 (2011).
- Ritsma, L., et al. Intravital microscopy through an abdominal imaging window reveals a pre-micrometastasis stage during liver metastasis. Sci Transl Med. 4 (158), 158ra145 (2012).
- Sierro, F., et al. A Liver Capsular Network of Monocyte-Derived Macrophages Restricts Hepatic Dissemination of Intraperitoneal Bacteria by Neutrophil Recruitment. Immunity. 47 (2), 374-388 (2017).
- Faust, N., Varas, F., Kelly, L. M., Heck, S., Graf, T. Insertion of enhanced green fluorescent protein into the lysozyme gene creates mice with green fluorescent granulocytes and macrophages. Blood. 96 (2), 719-726 (2000).
- Jung, S., et al. Analysis of fractalkine receptor CX(3)CR1 function by targeted deletion and green fluorescent protein reporter gene insertion. Mol Cell Biol. 20 (11), 4106-4114 (2000).
- Heymann, F., et al. Long term intravital multiphoton microscopy imaging of immune cells in healthy and diseased liver using CXCR6.Gfp reporter mice. J Vis Exp. (97), (2015).
