Dos fotones Intravital proyección de imagen de leucocitos durante la respuesta inmunitaria en hígado de ratón tratados con lipopolisacárido
Summary
Establecimos un protocolo quirúrgico novedoso para la proyección de imagen de dos fotones de hígado en ratones con la invasión mínima. Con esta técnica identificamos la estructura detallada del hígado durante la endotoxemia inducida por lipopolisacáridos. Esperamos que este método puede utilizarse para determinar la efectividad del tratamiento de reactivos diferentes a la migración de leucocitos hepáticos.
Abstract
La sepsis es un tipo de infección grave que puede causar falta del órgano y tejido daños. Aunque las tasas de morbilidad y mortalidad asociada a sepsis son tratamiento muy alto, no directo o mecanismo relacionado con el órgano se ha examinado en detalle en tiempo real. El hígado es el órgano clave que administra las toxinas e infecciones en el cuerpo humano. En este documento, se intentó realizar intravital la proyección de imagen del hígado del ratón después de la inducción de endotoxemia para rastrear la motilidad de las células inmunes, tales como neutrófilos y macrófagos capsulares hepáticos (LCMs). Por consiguiente, hemos diseñado un nuevo método quirúrgico para la exposición del hígado con cirugía mínimamente invasiva. Ratones fueron inyectados por vía intraperitoneal con lipopolisacárido (LPS), una endotoxina común. Con nuestro nuevo enfoque quirúrgico para la exposición y la proyección de imagen intravital de la contratación de ratón, hígado, que encontramos del neutrófilo en proteína tratados con LPS LysM-verde fluorescente (GFP) hígado de ratón fue aumentada en comparación con los en tampón fosfato hígado tratados con solución salina. Después del tratamiento de LPS, el número de neutrófilos aumentó significativamente con el tiempo. Además, utilizando ratones CX3Cr1-GFP, con éxito visualizado hígados macrófagos residentes llamados LCMs. Por lo tanto, para investigar la eficacia de nuevos reactivos para el control inmune movilidad en vivo, determinar la motilidad y la morfología de los neutrófilos y LCMs en el hígado puede permitirnos identificar efecto terapéutico en órgano falla y tejidos daños causados por activación de leucocitos en la sepsis.
Introduction
El hígado es el órgano metabólico importante en mamíferos; actúa como una torre de control de energía, hormonas y la desintoxicación1. Debido a su importancia, los investigadores han llevado a cabo muchos experimentos in vitro e in vivo para aclarar los cambios en el hígado durante la inflamación. La microscopia intravital ha sido utilizada para capturar imágenes en vivo del hígado2 . De hecho, hígado varios métodos de proyección de imagen han sido introducido2,3,4,5,6. Sin embargo, con el fin de desarrollar un enfoque quirúrgico más simplificado y lograr la estabilización de órgano blanco y las células inmunes, se diseñó un protocolo simple que pueda guiar investigadores para minimizar su esfuerzo para la proyección de imagen intravital.
En este estudio, hemos introducido una cámara de proyección de imagen estable y novela y técnica quirúrgica que podría ser utilizado para minimizar el sangrado y posibles infecciones. Se confirmó que el hígado permaneció intacto por más de 2 h. Con este método, se identificaron con éxito morfología de neutrófilos bajo condición séptica y LCMs7 . Puesto que este método minimiza el físicos y biológicos factores de confusión tales como inflamación de temblor e inesperada durante el procedimiento quirúrgico, Anticipamos que este método podría ser utilizado para observar reacciones agudas de células inmunes en el hígado en respuesta a reactivos como LPS.
Protocol
Representative Results
Discussion
El hígado se ha estudiado activamente por muchos grupos3,10, debido a la importancia de su función. Por ejemplo, Heymann et al. sugirió un método delicado utilizando agarosa. Aunque este método fue encontrado para ser muy preciso, el ajuste de agarosa toma tiempo. Sin embargo, con nuestra metodología, todos los procedimientos pueden llevarse a cabo dentro de 30 minutos, reduciendo al mínimo otros factores de confusión. En segundo lugar, estabilizar el hí…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este estudio fue apoyado por una subvención de la nacional investigación Fundación de Corea (NRF) financiado por el gobierno de Corea (MSIP; subvención n ° 2016R1A2B4008199 Y m. H.) y el Ministerio de salud y bienestar, República de Corea (número: HI14C1324).
Materials
| Custom designed chamber | Live Cell Instruments | Custom-designed size | |
| Metal cover slide | Live Cell Instruments | Custom-designed size | |
| Cover glass | Electron Microscopy Sciences | #72204-03 | |
| Sylgard 184 Silicone elastomer kit | Dow Corning | ||
| Erlenmeyer flask | DURAN | 21 216 36 | |
| Cell culture plate (Flat type) | HYUNDAI Micro Co. | H31006 | |
| Desiccator | ADARSH | 55204 | |
| High Q BOND SE 5 mL | BJM LAB | To make semi-permanent dam | |
| Flexible Silicone Rubber Heaters | Omega | SRFR/SRFG SERIES, M1250/0800 | |
| DC power supply | Toyotech | DP30-03A | |
| Phosphate-buffered saline | Home-made | ||
| Lipopolysaccharides (LPS) from Salmonella enteria serotype enteritidis | Sigma-Aldrich | L6011 | |
| Texas Red Dextran | Thermo Fisher Scientific | D1830 | |
| 15 mL High-clarity polypropylene conical tube |
FALCON | 14-959-49B | |
| 0.45 μm filter (Minisart Syringe Filter) | Sartorius | 16555k | |
| 1.5ml Micro Tube, Amber | Axygen | MCT-150-X | For light-blocking |
| 1 mL syringe | Korea Vaccine | KV-S01 | |
| 3 mL syringe | Korea Vaccine | KV-S03 | |
| 10 mL syringe | Korea Vaccine | KV-S10 | |
| 0.3 mL insulin syringe | Becton Dickinson | 324900 | |
| Hair removal cream 100 mL | Body natur | ||
| Cotton swab | ABDI | ||
| Zoletil 50 5 mL | Virbac | ||
| Rompun 10 mL | Bayer | ||
| Heating plate | Live Cell Instruments | PH-S-10 | Custom-designed size |
| DC controller | Live Cell Instruments | CU-301 | |
| Microdessection Scissors | Harvard Apparatus | 72-5418 | |
| Scissors | Roboz | RS-5882 | |
| Forceps | Roboz | RS-5137 | |
| Vet bond | 3M | 1469SB | |
| ZEN software (Black Edition) | Carl Zeiss | Program for LSM 7 MP | |
| LSM 7 MP | Carl Zeiss | ||
| Volocity | PerkinElmer | Analysis program |
References
- Girard, J. R., et al. Fuels, hormones, and liver metabolism at term and during the early postnatal period in the rat. J Clin Invest. 52 (12), 3190-3200 (1973).
- Marques, P. E., et al. Imaging liver biology in vivo using conventional confocal microscopy. Nat Protoc. 10 (2), 258-268 (2015).
- Dasari, S., Weber, P., Makhloufi, C., Lopez, E., Forestier, C. L. Intravital Microscopy Imaging of the Liver following Leishmania Infection: An Assessment of Hepatic Hemodynamics. J Vis Exp. (101), e52303 (2015).
- Honda, M., et al. Intravital imaging of neutrophil recruitment in hepatic ischemia-reperfusion injury in mice. Transplantation. 95 (4), 551-558 (2013).
- Jenne, C. N., Wong, C. H., Petri, B., Kubes, P. The use of spinning-disk confocal microscopy for the intravital analysis of platelet dynamics in response to systemic and local inflammation. PLoS One. 6 (9), e25109 (2011).
- Ritsma, L., et al. Intravital microscopy through an abdominal imaging window reveals a pre-micrometastasis stage during liver metastasis. Sci Transl Med. 4 (158), 158ra145 (2012).
- Sierro, F., et al. A Liver Capsular Network of Monocyte-Derived Macrophages Restricts Hepatic Dissemination of Intraperitoneal Bacteria by Neutrophil Recruitment. Immunity. 47 (2), 374-388 (2017).
- Faust, N., Varas, F., Kelly, L. M., Heck, S., Graf, T. Insertion of enhanced green fluorescent protein into the lysozyme gene creates mice with green fluorescent granulocytes and macrophages. Blood. 96 (2), 719-726 (2000).
- Jung, S., et al. Analysis of fractalkine receptor CX(3)CR1 function by targeted deletion and green fluorescent protein reporter gene insertion. Mol Cell Biol. 20 (11), 4106-4114 (2000).
- Heymann, F., et al. Long term intravital multiphoton microscopy imaging of immune cells in healthy and diseased liver using CXCR6.Gfp reporter mice. J Vis Exp. (97), (2015).
