Estabelecemos um protocolo cirúrgico romance para a imagem latente de dois fotões de fígado de ratos ao vivo com invasão mínima. Com esta técnica, identificamos a estrutura detalhada do fígado durante endotoxemia induzidas pelo lipopolissacarídeo. Nós antecipamos que este método pode ser utilizado para determinar a eficácia de vários tratamentos de reagentes para migração de leucócitos hepática.
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Artigo de método
Imagem de Intravital dois fotões de leucócitos durante a resposta imune em fígado de rato lipopolissacarídeo-tratados
* These authors contributed equally
Neste artigo
Resumo
Resumo
Sepse é um tipo de infecção grave que pode causar a falha de órgãos e tecidos danos. Embora as taxas de mortalidade e morbidade associada com sepse são extremamente elevado, não direto tratamento ou órgãos relacionados com o mecanismo foi examinado em detalhes em tempo real. O fígado é o órgão chave que gerencia as toxinas e infecções no corpo humano. Neste documento, tivemos como objetivo realizar intravital imagem latente do fígado de rato após indução de endotoxemia para acompanhar a motilidade das células do sistema imunológico, tais como neutrófilos e macrófagos capsulares hepáticas (LCMs). Nesse sentido, nós projetamos um novo método cirúrgico para exposição do fígado com cirurgia minimamente invasiva. Os ratos foram injetados intraperitonealmente com lipopolissacarídeo (LPS), um endotoxina comum. Usando nossa nova abordagem cirúrgica para exposição e intravital imagem do recrutamento rato fígado, que encontramos o neutrófilo em proteína de LPS-tratados LysM-verde fluorescente (GFP) fígado de rato foi aumentado em comparação com isso em tampão fosfato fígado de tratados com solução salina. Após o tratamento de LPS, o número de neutrófilos aumentou significativamente com o tempo. Além disso, estamos com êxito usando ratos CX3Cr1-GFP, visualizado fígados macrófagos residentes chamados LCMs. Portanto, para investigar a eficácia de novos reagentes para controlar a mobilidade imune na vivo, determinando a motilidade e morfologia dos neutrófilos e LCMs no fígado pode permitem identificar efeito terapêutico no órgão falha e tecido danos causados por ativação de leucócitos na sepse.
Introdução
O fígado é o órgão metabólico importante nos mamíferos; Ele atua como uma torre de controle para desintoxicação, hormônios e energia1. Devido à sua importância, os pesquisadores realizaram muitos experimentos in vitro e in vivo para elucidar as alterações no fígado durante a inflamação. A microscopia intravital tem sido usada para capturar imagens ao vivo do fígado2 . Com efeito, fígado de vários métodos de imagem têm sido introduzidos2,3,4,5,6
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Protocolo
Todos os procedimentos foram realizados em conformidade com as diretrizes do Comitê de uso de Yonsei Universidade faculdade de medicina, Coreia e institucional Cuidado Animal. Proteína de LysM-verde fluorescente (GFP; gfp / +) ratos8 e CX3Cr1-GFP (gfp / +)9 ratos em 8-12 semanas de idade foram utilizados para a imagem latente intravital. Todos os instrumentos cirúrgicos foram esterilizados e desinfetados com álcool a 70%.
1. personalizados rato fígado câmara com apoio de ferramentas de imagem
- Fígado de rato de imagem projeto câmara
- Fazer uma câmara do seguinte tamanho de fíga....
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Resultados
Foi criada uma câmara de imagens simples e muito estável. Parte inferior da câmara estava coberta com silicone, que impediu a escorregar do rato corpo e órgãos. Além disso, porque o silício tem a quantidade adequada de elasticidade, poderia impedir esperado danos induzidos pela pressão do slide tampa (figura 1A, C). Segunda, tecido-cofre cola (sulfite de Vet) foi aplicada a fim reparar o fígado extraído na cama do silicone em forma de círculo.......
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Discussão
O fígado tem sido ativamente estudado por muitos grupos3,10, devido à importância da sua função. Por exemplo, Heymann et al sugeriram um método delicado usando agarose. Embora esse método foi encontrado para ser altamente precisos, a configuração de agarose leva tempo. Todavia, com nossa metodologia, todos os procedimentos podem ser efectuados dentro de 30 min, minimizando outros fatores de confundimento. Em segundo lugar, estabilizar o fígado é extremamente impo.......
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Divulgações
Os autores declaram não concorrentes interesses financeiros.
Agradecimentos
Este estudo foi suportado por um fundo de nacional pesquisa Fundação de Coreia (NRF) financiado pelo governo da Coreia (MSIP; concessão n. º 2016R1A2B4008199, Y-m. H.) e o Ministério da saúde & bem-estar, República da Coreia (número de concessão: HI14C1324).
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Câmara projetada para instrumentos | de célula | Tamanho personalizado | |
| Slide de tampa de metal | Instrumentos | Tamanho personalizado | |
| Vidro de cobertura | Eletrônica Microscopia Sciences | #72204-03 | |
| Sylgard 184 Kit de elastômero de silicone | Dow Corning | ||
| Frasco Erlenmeyer | DURAN | 21 216 36 | |
| Placa de cultura celular (tipo plano) | HYUNDAI Micro Co. | H31006 | |
| Dessecador | ADARSH | 55204 | |
| High Q BOND SE 5 mL | BJM LAB | Para fazer barragem semi-permanente | |
| Aquecedores flexíveis de borracha de silicone | Omega | SRFR/SRFG SERIES, M1250/0800 | |
| Fonte de alimentação DC | Toyotech | DP30-03A | |
| Solução salina | |||
| tamponada com fosfatoLipopolissacarídeos (LPS) de Salmonella enteria sorotipo enteritidis | Sigma-Aldrich | L6011 | |
| Texas Red Dextran | Thermo Fisher Scientific | D1830 | |
| 15 mL Tubo cônico de polipropileno de alta clareza | FALCON | 14-959-49B | |
| 0,45 μ filtro m (filtro de seringa Minisart) | Sartorius | 16555k | |
| 1,5 ml Micro Tubo, âmbar | Axygen | MCT-150-X | Para seringa de bloqueio de luz |
| 1 mL | Vacina da Coréia | KV-S01 | |
| Seringa de 3 mL | Vacina da Coréia | KV-S03 | |
| Seringa de 10 mL | Vacina da Coréia | KV-S10 | |
| Seringa de insulina de 0,3 mL | Becton Dickinson | 324900 | |
| Creme de depilação 100 mL | Body natur | ||
| Cotonete | ABDI | ||
| Zoletil 50 5 mL | Virbac | ||
| Rompun 10 mL | Bayer | ||
| Placa de aquecimento | Instrumentos de célula viva | PH-S-10 | Controlador DC de tamanho personalizado |
| Instrumentos | de célula viva-301 | ||
| Microdissecação Tesoura | Harvard Apparatus | 72-5418 | |
| Tesoura | Roboz | RS-5882 | |
| Fórceps | Roboz | RS-5137 | |
| Vet bond | 3M | 1469SB | |
| ZEN software (Black Edition) | Carl Zeiss | para LSM 7 MP | |
| LSM 7 MP | Carl Zeiss | ||
| Programa de Análise Volocity | PerkinElmer |
Referências
- Girard, J. R., et al. Fuels, hormones, and liver metabolism at term and during the early postnatal period in the rat. J Clin Invest. 52 (12), 3190-3200 (1973).
- Marques, P. E., et al. Imaging liver biology in vivo using conventional co....
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Reimpressões e permissões
