Two-photon Imaging intravitale des leucocytes au cours de la réponse immunitaire dans le foie de souris traitées Lipopolysaccharide
Summary
Nous avons mis en place un nouveau protocole chirurgical pour l’imagerie de deux photons de foie de souris vivantes à invasion minimale. Avec cette technique, nous avons identifié la structure détaillée du foie au cours de l’endotoxémie induite par le lipopolysaccharide. Nous prévoyons que cette méthode peut être utilisée pour déterminer l’efficacité de divers traitements de réactifs pour la migration des leucocytes hépatique.
Abstract
Septicémie est une infection grave qui peut entraîner la défaillance d’organes et tissus des dommages. Bien que le taux de mortalité et de morbidité associée à une septicémie sont extrêmement élevé, non direct traitement ou mécanisme axés sur l’orgue a été examinée en détail en temps réel. Le foie est l’organe clé qui gère les toxines et les infections dans le corps humain. Dans les présentes, visait à effectuer intravitale imagerie du foie de souris après induction de l’endotoxémie afin de suivre la motilité des cellules immunitaires, tels que les neutrophiles et les macrophages capsulaires du foie (LCMs). En conséquence, nous avons conçu une nouvelle méthode chirurgicale pour l’exposition du foie avec la chirurgie mini-invasive. Souris ont été injectées par voie intrapéritonéale avec lipopolysaccharide (LPS), une endotoxine commun. À l’aide de notre nouvelle approche chirurgicale pour l’exposition et l’imagerie intravitale du recrutement du foie, que nous avons constaté que les neutrophiles des souris en protéine fluorescente LPS-traités LysM-verte (GFP) foie de souris a été augmenté par rapport à celle en tampon phosphate imprégnées d’une solution saline foie. Après traitement de LPS, le nombre de neutrophiles augmente sensiblement avec le temps. En outre, à l’aide de souris CX3Cr1-GFP, nous avons visualisé avec succès macrophages résidents du foie appelées LCMs. Donc, pour étudier l’efficacité de nouveaux réactifs pour contrôler la mobilité immunitaire in vivo, déterminer la motilité et la morphologie des neutrophiles et LCMs dans le foie peut nous permettent d’identifier un effet thérapeutique orgue échec et tissus des dommages causés par activation des leucocytes en septicémie.
Introduction
Le foie est l’organe métabolique majeur chez les mammifères ; Il agit comme une tour de contrôle de l’énergie, hormones et désintoxication1. En raison de son importance, les chercheurs ont mené plusieurs expériences in vitro et in vivo afin d’élucider les changements dans le foie lors d’une inflammation. La microscopie intravitale a été utilisée pour capturer des images en direct de la foie2 . En effet, foie de différentes méthodes d’imagerie ont été introduit2,3,4,5,6. Toutefois, afin de développer une approche chirurgicale plus simplifiée et parvenir à la stabilisation de l’organe cible et les cellules immunitaires, nous avons conçu un protocole simple qui peut guider les chercheurs afin de minimiser leur effort pour l’imagerie intravitale.
Dans cette étude, nous avons introduit un stable et roman chambre d’imagerie et la technique chirurgicale qui pourrait servir à réduire les saignements et de possibles infections. Nous avons confirmé que le foie est demeurée intact pendant plus de 2 h. Avec cette méthode, nous avons identifié avec succès morphologies de LCMs7 et neutrophiles en vertu de l’État septique. Car cette méthode réduit au minimum les facteurs confondants physiques et biologiques telles que l’inflammation tremblotante et inattendue au cours de l’intervention chirurgicale, nous prévoyons que cette méthode pourrait être utilisée pour observer les réactions aiguës des cellules immunitaires dans le foie en réponse à réactifs comme LPS.
Protocol
Representative Results
Discussion
Le foie a été activement étudié par de nombreux groupes3,10, en raison de l’importance de sa fonction. Par exemple, Heymann et coll. a proposé une méthode délicate à l’aide de gel d’agarose. Bien que cette méthode s’est avérée pour être très précis, le réglage de l’agarose prend du temps. Toutefois, avec notre méthodologie, toutes les procédures pourraient être effectuées dans les 30 minutes, réduisant au minimum les autres facteurs …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Cette étude a été financée par une subvention de la Fondation de la recherche nationale de Corée (NRF) financé par le gouvernement de la Corée (MSIP ; subvention no 2016R1A2B4008199 à Y-M. H.) et le ministère de la santé et du bien-être social, République de Corée (numéro de licence : HI14C1324).
Materials
| Custom designed chamber | Live Cell Instruments | Custom-designed size | |
| Metal cover slide | Live Cell Instruments | Custom-designed size | |
| Cover glass | Electron Microscopy Sciences | #72204-03 | |
| Sylgard 184 Silicone elastomer kit | Dow Corning | ||
| Erlenmeyer flask | DURAN | 21 216 36 | |
| Cell culture plate (Flat type) | HYUNDAI Micro Co. | H31006 | |
| Desiccator | ADARSH | 55204 | |
| High Q BOND SE 5 mL | BJM LAB | To make semi-permanent dam | |
| Flexible Silicone Rubber Heaters | Omega | SRFR/SRFG SERIES, M1250/0800 | |
| DC power supply | Toyotech | DP30-03A | |
| Phosphate-buffered saline | Home-made | ||
| Lipopolysaccharides (LPS) from Salmonella enteria serotype enteritidis | Sigma-Aldrich | L6011 | |
| Texas Red Dextran | Thermo Fisher Scientific | D1830 | |
| 15 mL High-clarity polypropylene conical tube |
FALCON | 14-959-49B | |
| 0.45 μm filter (Minisart Syringe Filter) | Sartorius | 16555k | |
| 1.5ml Micro Tube, Amber | Axygen | MCT-150-X | For light-blocking |
| 1 mL syringe | Korea Vaccine | KV-S01 | |
| 3 mL syringe | Korea Vaccine | KV-S03 | |
| 10 mL syringe | Korea Vaccine | KV-S10 | |
| 0.3 mL insulin syringe | Becton Dickinson | 324900 | |
| Hair removal cream 100 mL | Body natur | ||
| Cotton swab | ABDI | ||
| Zoletil 50 5 mL | Virbac | ||
| Rompun 10 mL | Bayer | ||
| Heating plate | Live Cell Instruments | PH-S-10 | Custom-designed size |
| DC controller | Live Cell Instruments | CU-301 | |
| Microdessection Scissors | Harvard Apparatus | 72-5418 | |
| Scissors | Roboz | RS-5882 | |
| Forceps | Roboz | RS-5137 | |
| Vet bond | 3M | 1469SB | |
| ZEN software (Black Edition) | Carl Zeiss | Program for LSM 7 MP | |
| LSM 7 MP | Carl Zeiss | ||
| Volocity | PerkinElmer | Analysis program |
References
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