Lipopolysaccharide 취급 마우스 간에 면역 반응 동안 백혈구의 2 광자 Intravital 이미징
Summary
우리는 최소한의 침공과 라이브 쥐 간 2 광자 영상에 대 한 새로운 수술 프로토콜을 설립. 이 기술을 우리 lipopolysaccharide 유도 endotoxemia 동안 간의 상세한 구조를 확인 할 수 있습니다. 우리는이 방법을 간 백혈구 이동에 다양 한 시 약 처리의 효과 결정 하기 위해 활용 될 수 있습니다 예상.
Abstract
패 혈 증은 조직 기관 실패를 일으킬 수 있는 심각한 감염의 유형을 손상. 패 혈 증과 관련 된 사망률과 병 적 속도 매우 높은, 아니 직접 치료 이나 기관 관련 메커니즘을 실시간으로 자세히 검사 합니다. 간 독 소 및 인체에 감염을 관리 하는 핵심 기관 이다. 여기, 우리 면역 세포, 호 중구 등 간 capsular 세포 (LCMs)의 운동 성을 추적 endotoxemia의 유도 후 마우스 간 intravital 이미징 수행 목적입니다. 따라서, 우리는 최소 침 습 수술으로 간의 노출에 대 한 새로운 수술 방법 설계 되었습니다. 마우스 intraperitoneally lipopolysaccharide (LPS), 일반적인도로 주입 했다. 노출 및 LPS 처리 LysM-녹색 형광 단백질 (GFP)에 마우스 간, 우리는 그 neutrophil 발견 채용의 intravital 이미징에 대 한 우리의 새로운 외과 접근을 사용 하 여 마우스 간 그 인산 염 버퍼에 비해 증가 했다 염 분 처리 간입니다. LPS 치료 후, 호 중구 수 시간 크게 증가. 또한, 우리가 성공적으로 간 상주 대 식 세포 라는 LCMs 시각 CX3Cr1 GFP 마우스를 사용 하 여. 따라서, vivo에서면역 이동성 제어를 새로운 시 약의 효능을 조사, 운동 성 및 간에서 호 중구 및 LCMs의 형태 결정 수 기관 실패 및 조직 손상으로 인 한 치료 효과 확인 하 패 혈 증에 백혈구 활성화입니다.
Introduction
간은 포유류; 주요 대사 기관 그것은 에너지, 호르몬, 및 해독1에 대 한 컨트롤 타워 역할을 합니다. 그 중요성으로 인해 연구팀은 염증 동안에 변화를 명료 하 많은 생체 외에서 그리고 vivo에서 실험을 실시 했습니다. Intravital 현미경 검사 법은 간2 에서 라이브 이미지를 캡처하는 데 사용 되었습니다. 실제로, 다양 한 간 이미징 방법 되었습니다 도입2,,34,,56. 그러나, 더 단순화 된 외과 접근을 개발 하 고 대상 기관 및 면역 세포의 안정화를 달성, 우리는 intravital 이미징에 대 한 그들의 노력을 최소화 하기 위해 연구원 안내 하는 간단한 프로토콜을 설계 되었습니다.
이 연구에서 우리는 안정적이 고 새로운 이미징 챔버 및 출혈 및 가능한 감염을 최소화 하기 위해 사용 될 수 있는 수술 기법 도입. 우리는 간 이상 2 시간에 대 한 온전 하 게 남아 확인 했다. 이 방법으로, 우리는 성공적으로 LCMs7 및 부패 시키는 조건 하에서 호 중구의 형태학 식별. 이 방법에 대 한 응답에서에 면역 세포의 급성 반응을 관찰 하 사용 될 수 있기 때문에이 방법은 수술 중 떨림과 예기치 않은 염증 등 물리적 및 생물학적 혼동 요인 최소화, 기대 시 약 같은 LPS.
Protocol
Representative Results
Discussion
간은 많은 그룹3,10, 그것의 기능의 중요성 때문에 의해 적극적으로 연구 되었습니다. 예를 들어, Heymann 외. agarose를 사용 하 여 섬세 한 방법을 제안 했다. 이 메서드는 매우 정확 하 게 발견 되었다, agarose 설정 시간이 걸립니다. 그러나, 우리의 방법론으로 모든 절차 수 실행 될 다른 혼동 요인을 최소화 하는 30 분 이내. 하트 비트 비디오를 방해 할 수 있?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 연구는 교부 금에서 국가 연구 재단의 한국 (NRF) (MSIP; 보조금 번호 2016R1A2B4008199 Y-m 한국 정부에 의해 자금에 의해 지원 되었다. H.)와 사역의 건강 및 복지, 한국 (번호 부여: HI14C1324).
Materials
| Custom designed chamber | Live Cell Instruments | Custom-designed size | |
| Metal cover slide | Live Cell Instruments | Custom-designed size | |
| Cover glass | Electron Microscopy Sciences | #72204-03 | |
| Sylgard 184 Silicone elastomer kit | Dow Corning | ||
| Erlenmeyer flask | DURAN | 21 216 36 | |
| Cell culture plate (Flat type) | HYUNDAI Micro Co. | H31006 | |
| Desiccator | ADARSH | 55204 | |
| High Q BOND SE 5 mL | BJM LAB | To make semi-permanent dam | |
| Flexible Silicone Rubber Heaters | Omega | SRFR/SRFG SERIES, M1250/0800 | |
| DC power supply | Toyotech | DP30-03A | |
| Phosphate-buffered saline | Home-made | ||
| Lipopolysaccharides (LPS) from Salmonella enteria serotype enteritidis | Sigma-Aldrich | L6011 | |
| Texas Red Dextran | Thermo Fisher Scientific | D1830 | |
| 15 mL High-clarity polypropylene conical tube |
FALCON | 14-959-49B | |
| 0.45 μm filter (Minisart Syringe Filter) | Sartorius | 16555k | |
| 1.5ml Micro Tube, Amber | Axygen | MCT-150-X | For light-blocking |
| 1 mL syringe | Korea Vaccine | KV-S01 | |
| 3 mL syringe | Korea Vaccine | KV-S03 | |
| 10 mL syringe | Korea Vaccine | KV-S10 | |
| 0.3 mL insulin syringe | Becton Dickinson | 324900 | |
| Hair removal cream 100 mL | Body natur | ||
| Cotton swab | ABDI | ||
| Zoletil 50 5 mL | Virbac | ||
| Rompun 10 mL | Bayer | ||
| Heating plate | Live Cell Instruments | PH-S-10 | Custom-designed size |
| DC controller | Live Cell Instruments | CU-301 | |
| Microdessection Scissors | Harvard Apparatus | 72-5418 | |
| Scissors | Roboz | RS-5882 | |
| Forceps | Roboz | RS-5137 | |
| Vet bond | 3M | 1469SB | |
| ZEN software (Black Edition) | Carl Zeiss | Program for LSM 7 MP | |
| LSM 7 MP | Carl Zeiss | ||
| Volocity | PerkinElmer | Analysis program |
References
- Girard, J. R., et al. Fuels, hormones, and liver metabolism at term and during the early postnatal period in the rat. J Clin Invest. 52 (12), 3190-3200 (1973).
- Marques, P. E., et al. Imaging liver biology in vivo using conventional confocal microscopy. Nat Protoc. 10 (2), 258-268 (2015).
- Dasari, S., Weber, P., Makhloufi, C., Lopez, E., Forestier, C. L. Intravital Microscopy Imaging of the Liver following Leishmania Infection: An Assessment of Hepatic Hemodynamics. J Vis Exp. (101), e52303 (2015).
- Honda, M., et al. Intravital imaging of neutrophil recruitment in hepatic ischemia-reperfusion injury in mice. Transplantation. 95 (4), 551-558 (2013).
- Jenne, C. N., Wong, C. H., Petri, B., Kubes, P. The use of spinning-disk confocal microscopy for the intravital analysis of platelet dynamics in response to systemic and local inflammation. PLoS One. 6 (9), e25109 (2011).
- Ritsma, L., et al. Intravital microscopy through an abdominal imaging window reveals a pre-micrometastasis stage during liver metastasis. Sci Transl Med. 4 (158), 158ra145 (2012).
- Sierro, F., et al. A Liver Capsular Network of Monocyte-Derived Macrophages Restricts Hepatic Dissemination of Intraperitoneal Bacteria by Neutrophil Recruitment. Immunity. 47 (2), 374-388 (2017).
- Faust, N., Varas, F., Kelly, L. M., Heck, S., Graf, T. Insertion of enhanced green fluorescent protein into the lysozyme gene creates mice with green fluorescent granulocytes and macrophages. Blood. 96 (2), 719-726 (2000).
- Jung, S., et al. Analysis of fractalkine receptor CX(3)CR1 function by targeted deletion and green fluorescent protein reporter gene insertion. Mol Cell Biol. 20 (11), 4106-4114 (2000).
- Heymann, F., et al. Long term intravital multiphoton microscopy imaging of immune cells in healthy and diseased liver using CXCR6.Gfp reporter mice. J Vis Exp. (97), (2015).
