To-fotonet Intravital Imaging av leukocytter under immunrespons i lipopolysakkarid-behandlet musen leveren
Summary
Vi etablert en roman kirurgisk protokoll for to-fotonet bildebehandling av levende mus lever med minimal invasjonen. Med denne teknikken identifisert vi detaljert strukturen i leveren under lipopolysakkarid-indusert endotoxemia. Vi forventer at denne metoden kan brukes til å fastslå effekten av ulike reagenser behandlingen til hepatic leukocytter migrasjon.
Abstract
Sepsis er en alvorlig infeksjon som kan forårsake organ dårlig og vev skade. Selv om dødelighet og sykelighet priser knyttet til sepsis meget er ekstremt høy, ikke direkte behandling eller orgel-relaterte mekanisme har vært undersøkt i detalj i sanntid. Leveren er det viktige orglet som administrerer toksiner og infeksjoner i menneskekroppen. Her, rettet vi å utføre intravital avbildning av musen lever etter induksjon av endotoxemia for å spore motilitet av immunceller, for eksempel nøytrofile og leveren capsular makrofager (LCMs). Derfor designet vi en roman kirurgisk metode for eksponering av leveren med minimal invasiv kirurgi. Mus ble intraperitoneally injisert med lipopolysakkarid (LPS), en felles endotoxin. Med vårt romanen kirurgisk tilnærming for eksponering og intravital bildebehandling av musen lever, fant vi at nøytrofile rekruttering i LPS-behandlet LysM-grønn fluorescerende protein (GFP) økte musen leveren sammenlignet med det i fosfat-bufret Saline-behandlet leveren. Etter LPS behandling økt antall nøytrofile betydelig med tid. I tillegg visualisert bruker CX3Cr1-GFP mus, vi er leveren bosatt makrofager kalt LCMs. Derfor undersøke virkningen av ny reagenser til å styre immun mobilitet i vivo, kan å bestemme motilitet og morfologi av nøytrofile og LCMs i leveren tillate oss å identifisere terapeutisk effekt orgel svikt og vev skade forårsaket av leukocytter aktivisering i sepsis.
Introduction
Leveren er den store metabolske orgelet i pattedyr; det fungerer som et tårn for energi, hormoner og avgiftning1. På grunn av dens betydning, har forskere gjennomført mange i vitro og vivo eksperimenter for å belyse endringer i leveren ved betennelser. Intravital mikroskopi er brukt til å fange levende bilder fra lever2 . Faktisk introdusert ulike leveren tenkelig metoder har blitt2,3,4,5,6. Men for å utvikle en mer forenklet kirurgisk tilnærming og oppnå stabilisering av målet orgel og immunceller, utviklet vi en enkel protokoll som kan veilede forskere for å minimere deres innsats for intravital avbildning.
I denne studien innført vi en stabil og romanen tenkelig kammer og kirurgisk teknikk som kan brukes til å minimere blødning og mulige infeksjoner. Vi bekreftet at leveren forble intakt for mer enn 2 timer. Med denne metoden identifisert vi morphologies LCMs7 og nøytrofile under septisk tilstand. Siden denne metoden reduserer fysiske og biologiske forvirrende faktorer som skjelving og uventet betennelse i kirurgiske prosedyren, forventer vi at denne metoden kan brukes til å observere akutte reaksjoner av immunceller i leveren svar reagenser som LPS.
Protocol
Representative Results
Discussion
Leveren er aktivt studert av mange grupper3,10, på grunn av viktigheten av funksjonen. For eksempel foreslo Heymann et al. en delikat metode som bruker agarose. Selv om denne metoden ble funnet for å være svært nøyaktig, tar innstillingen agarose tid. Men med vår metodikk, kan alle prosedyrer utføres innen 30 min, minimere andre forvirrende faktorer. Andre er stabilisere leveren svært viktig fordi hjerterytme kan forstyrre videoen. For å eliminere dette …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Denne studien ble støttet av et stipend fra National Research Foundation av Korea (NRF) finansiert av Korea regjeringen (MSIP, grant nr. 2016R1A2B4008199 Y-m. H.), og helse og velferd, Sør-Korea (gi nummer: HI14C1324).
Materials
| Custom designed chamber | Live Cell Instruments | Custom-designed size | |
| Metal cover slide | Live Cell Instruments | Custom-designed size | |
| Cover glass | Electron Microscopy Sciences | #72204-03 | |
| Sylgard 184 Silicone elastomer kit | Dow Corning | ||
| Erlenmeyer flask | DURAN | 21 216 36 | |
| Cell culture plate (Flat type) | HYUNDAI Micro Co. | H31006 | |
| Desiccator | ADARSH | 55204 | |
| High Q BOND SE 5 mL | BJM LAB | To make semi-permanent dam | |
| Flexible Silicone Rubber Heaters | Omega | SRFR/SRFG SERIES, M1250/0800 | |
| DC power supply | Toyotech | DP30-03A | |
| Phosphate-buffered saline | Home-made | ||
| Lipopolysaccharides (LPS) from Salmonella enteria serotype enteritidis | Sigma-Aldrich | L6011 | |
| Texas Red Dextran | Thermo Fisher Scientific | D1830 | |
| 15 mL High-clarity polypropylene conical tube |
FALCON | 14-959-49B | |
| 0.45 μm filter (Minisart Syringe Filter) | Sartorius | 16555k | |
| 1.5ml Micro Tube, Amber | Axygen | MCT-150-X | For light-blocking |
| 1 mL syringe | Korea Vaccine | KV-S01 | |
| 3 mL syringe | Korea Vaccine | KV-S03 | |
| 10 mL syringe | Korea Vaccine | KV-S10 | |
| 0.3 mL insulin syringe | Becton Dickinson | 324900 | |
| Hair removal cream 100 mL | Body natur | ||
| Cotton swab | ABDI | ||
| Zoletil 50 5 mL | Virbac | ||
| Rompun 10 mL | Bayer | ||
| Heating plate | Live Cell Instruments | PH-S-10 | Custom-designed size |
| DC controller | Live Cell Instruments | CU-301 | |
| Microdessection Scissors | Harvard Apparatus | 72-5418 | |
| Scissors | Roboz | RS-5882 | |
| Forceps | Roboz | RS-5137 | |
| Vet bond | 3M | 1469SB | |
| ZEN software (Black Edition) | Carl Zeiss | Program for LSM 7 MP | |
| LSM 7 MP | Carl Zeiss | ||
| Volocity | PerkinElmer | Analysis program |
References
- Girard, J. R., et al. Fuels, hormones, and liver metabolism at term and during the early postnatal period in the rat. J Clin Invest. 52 (12), 3190-3200 (1973).
- Marques, P. E., et al. Imaging liver biology in vivo using conventional confocal microscopy. Nat Protoc. 10 (2), 258-268 (2015).
- Dasari, S., Weber, P., Makhloufi, C., Lopez, E., Forestier, C. L. Intravital Microscopy Imaging of the Liver following Leishmania Infection: An Assessment of Hepatic Hemodynamics. J Vis Exp. (101), e52303 (2015).
- Honda, M., et al. Intravital imaging of neutrophil recruitment in hepatic ischemia-reperfusion injury in mice. Transplantation. 95 (4), 551-558 (2013).
- Jenne, C. N., Wong, C. H., Petri, B., Kubes, P. The use of spinning-disk confocal microscopy for the intravital analysis of platelet dynamics in response to systemic and local inflammation. PLoS One. 6 (9), e25109 (2011).
- Ritsma, L., et al. Intravital microscopy through an abdominal imaging window reveals a pre-micrometastasis stage during liver metastasis. Sci Transl Med. 4 (158), 158ra145 (2012).
- Sierro, F., et al. A Liver Capsular Network of Monocyte-Derived Macrophages Restricts Hepatic Dissemination of Intraperitoneal Bacteria by Neutrophil Recruitment. Immunity. 47 (2), 374-388 (2017).
- Faust, N., Varas, F., Kelly, L. M., Heck, S., Graf, T. Insertion of enhanced green fluorescent protein into the lysozyme gene creates mice with green fluorescent granulocytes and macrophages. Blood. 96 (2), 719-726 (2000).
- Jung, S., et al. Analysis of fractalkine receptor CX(3)CR1 function by targeted deletion and green fluorescent protein reporter gene insertion. Mol Cell Biol. 20 (11), 4106-4114 (2000).
- Heymann, F., et al. Long term intravital multiphoton microscopy imaging of immune cells in healthy and diseased liver using CXCR6.Gfp reporter mice. J Vis Exp. (97), (2015).
