Gel-seq: Um método para a preparação de biblioteca simultânea de sequenciamento de DNA e RNA usando matrizes de hidrogel

Summary

Gel-seq permite aos investigadores simultaneamente preparar bibliotecas para ambos DNA – e RNA-seq insignificante custo adicionado a partir de 100-1000 células usando um dispositivo simples de hidrogel. Este trabalho apresenta uma abordagem detalhada para a fabricação do dispositivo, bem como o protocolo biológico para gerar bibliotecas emparelhadas.

Abstract

A capacidade de amplificar e sequenciar o DNA ou RNA de pequenas amostras de partida só foi alcançada nos últimos cinco anos. Infelizmente, os protocolos padrão para gerar genômica ou transcriptomic bibliotecas são incompatíveis e pesquisadores devem escolher-se para sequenciar o DNA ou RNA para uma determinada amostra. Gel-seq resolve esse problema permitindo que pesquisadores preparar simultaneamente bibliotecas para DNA e RNA, começando com 100-1000 células usando um dispositivo simples de hidrogel. Este trabalho apresenta uma abordagem detalhada para a fabricação do dispositivo, bem como o protocolo biológico para gerar bibliotecas emparelhadas. Nós projetamos Gel-seq para que ele pode ser facilmente implementado por outros pesquisadores; muitos laboratórios de genética já tem o equipamento necessário para reproduzir a fabricação do dispositivo de Gel-seq. Nosso protocolo emprega comumente usados kits para ambos os todo-transcrição de amplificação (WTA) e preparação da biblioteca, que também são susceptíveis de ser familiar para os investigadores já versado na geração de genômica e transcriptomic bibliotecas. Nossa abordagem permite que os pesquisadores trazer para suportar o poder de sequenciamento de DNA e o RNA em uma única amostra sem divisão e com custo insignificante adicionado.

Introduction

Próxima geração (NGS) de sequenciamento teve um profundo impacto no caminho a pesquisa genética é realizada. Onde pesquisadores uma vez focada no sequenciamento do genoma de uma espécie inteira, é agora possível sequenciar o genoma de um tumor único ou até mesmo uma única célula em um experimento. ¹ NGS também tornou rentável para sequenciar os transcritos de RNA encontrados dentro de uma célula, uma coleção de dados conhecidos como a transcriptoma. A capacidade de amplificar e sequenciar o DNA ou RNA de pequenas amostras de partida só foi alcançada nos últimos cinco anos. ^{2 , 3 , 4} infelizmente, protocolos padrão são incompatíveis e pesquisadores devem escolher-se para sequenciar o DNA ou RNA para uma determinada amostra. Quando uma amostra inicial é grande o suficiente, ele pode ser dividido ao meio. Em escalas menores, no entanto, perda de material devido a separação de amostras pode afetar a qualidade da biblioteca, e pool de amostras pode média variações interessantes entre as células. ⁵ além disso, os pesquisadores estão cada vez mais interessados em examinar as amostras que não podem ser divididas, como células únicas ou biópsias de pequeno tumor heterogêneo. ⁶

Para resolver este problema, recentemente foram desenvolvidos três protocolos para sequenciar o DNA e o RNA da mesma amostra inicial: Gel-seq⁷, G & T-seq⁸e DR-seq⁹. Este artigo apresenta um protocolo detalhado para Gel-seq, que pode ser usado para gerar simultaneamente bibliotecas de DNA e RNA de apenas 100 células no custo adicionado insignificante. O aspecto inovador do Gel-seq é a capacidade de separar o DNA e RNA baseado exclusivamente no tamanho usando matrizes de hidrogel de baixo custo. A inovação do núcleo do protocolo Gel-Seq é a separação física do DNA do RNA. Esta separação é alcançada electrophoretically usando uma combinação de membranas de poliacrilamida que aproveitam as diferenças de tamanho entre estas moléculas. Para colocar estas diferenças de tamanho em contexto, considere como o DNA e RNA são fotografada: enquanto o ADN existe na escala de mícron e pode ser visualizado usando microscópios tradicionais, RNA existe na escala de nanômetros e deve ser fotografado usando técnicas complexas como cryo-elétron microscopia. ¹⁰

A abordagem para separação de DNA e RNA neste protocolo é mostrada na Figura 1. O painel esquerdo mostra DNA e RNA livram flutuação em solução perto de uma membrana. Quando um campo elétrico é aplicado, como mostrado no painel da direita, DNA e RNA experimentam uma força eletroforética que induz a migração através da membrana. Ajustando as propriedades da membrana, nós criamos uma membrana semipermeável que separa o DNA do RNA. As moléculas de DNA são empurradas contra a membrana, mas tornar-se enredado na borda, devido ao seu grande tamanho. Pequenas moléculas de RNA, por outro lado, podem reconfigurar e tecer sua maneira através da membrana. Este processo, conhecido como reptation, é similar à maneira que uma cobra se move pela grama. Eventualmente, estas moléculas de RNA são interrompidas por uma membrana de alta densidade, segunda que é muito difícil para polímeros ainda menores (> 200 pares de bases) de esquivar-se através de. Uma vez que fisicamente separados, DNA e RNA podem ser recuperado e processadas para gerar informação sobre o genoma e transcriptoma. Enquanto podemos separar DNA e RNA, encontramos melhores resultados são obtidos se o RNA é reverso transcrito de cDNA antes da separação. Os híbridos de cDNA/RNA são mais estáveis que o RNA sozinho e ainda podem passar através da membrana de baixa densidade.

Figura 1 . Princípio de funcionamento de gel-seq. O princípio subjacente usado para separar fisicamente o DNA e RNA. Em um campo elétrico aplicado, pequenas moléculas de RNA migram através da membrana de baixa densidade, mas grandes moléculas de DNA estão presas na superfície. Esta figura foi reproduzida da ref. 7 com a permissão da Real Sociedade de química. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Este paper descreve detalhadamente tanto a fabricação do Gel-seq dispositivo e o protocolo biológico para gerar emparelhado bibliotecas de DNA e RNA. Uma visão geral de ambos é mostrada na Figura 2. O dispositivo é fabricado pela estratificação três diferentes densidade geles de polyacrylamide em cima do outro em um processo semelhante à criação de gel de empilhamento padrão. ¹¹ o protocolo biológico começa com 100-1000 células suspendidas em PBS. As células lysed e o RNA é convertido em cDNA antes que o dispositivo é usado para separar os híbridos de cDNA/RNA o DNA genômico. Após a separação e recuperação, genômica e transcriptomic bibliotecas são preparadas com um processo que segue de perto o protocolo de kit de preparação de biblioteca padrão do inteiro-genoma. Mais detalhes sobre o desenvolvimento e validação de Gel-seq podem ser lido no laboratório em uma publicação de Chip “Gel-seq: do inteiro-genoma e transcriptoma sequenciamento por simultânea baixa-entrada DNA e RNA biblioteca preparação usando barreiras semi-permeáveis hidrogel .” ⁷

Figura 2 . Protocolo de gel-seq. Uma visão geral das etapas para fabricar o dispositivo Gel-seq e o protocolo gerado emparelhado bibliotecas de DNA e RNA. Porções desta figura foram reproduzidas de ref. 7 com a permissão da Real Sociedade de química. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Para gerar bibliotecas de DNA e RNA de células únicas, pesquisadores devem considerar o uso de G & T-seq ou Seq. DR G & T-Seq, como Gel-seq, se baseia em uma separação física do RNA do DNA genômico. Esta abordagem baseia-se no RNA mensageiro (mRNA) 3 ‘ polyadenylated cauda como um destino de suspenso. O mRNA é capturada em um grânulo magnético usando um primer de oligo-dT biotinilado. Uma vez que o mRNA foi capturado os grânulos são prendidos no lugar com um imã e o sobrenadante contendo o DNA genômico pode ser removido e transferido para outro tubo. Após concluir esta separação física, bibliotecas separadas podem ser geradas do mRNA e DNA. ⁸ esta abordagem funciona bem se o RNA de interesse é polyadenylated, porém não pode ser usado para estudar não-polyadenylated transcrições, tais como o RNA ribossomal, tRNA ou RNA de procariontes.

DR-seq baseia-se em uma etapa de pré-amplificação onde tanto o DNA e o cDNA derivados de RNA são amplificados no mesmo tubo. A amostra é então dividida em dois e processada em paralelo para preparar as bibliotecas de DNA e RNA-seq. Para distinguir entre DNA genômico e o cDNA derivados de RNA, DR-seq adota uma abordagem computacional. Sequências onde apenas exões estão presentes são computacionalmente suprimidas nos dados de DNA genômicos, como aqueles poderiam ter se originado de DNA ou RNA. ⁹ uma vantagem dessa abordagem é que o DNA e RNA de cDNA/precisam não ser fisicamente separados como é feito em Gel-seq e G & T-Seq A desvantagem, no entanto, é que DR-seq requer conhecimento a priori do genoma e transcriptoma (ou seja, exões contra os intrões) e talvez não seja ideal para aplicações tais como sequenciamento dos núcleos, no qual muitas transcrições ainda não são totalmente emendados e ainda contêm intrões. ¹²

O aspecto inovador do Gel-seq é a capacidade de separar o DNA e RNA em centenas de células com base exclusivamente em tamanho. Este método requer um priori nenhum conhecimento do genoma ou do transcriptoma, é robusto contra emenda incompleta e não está limitado a transcrições de poli-adenylated. Para aplicações onde um pesquisador pode começar com pelo menos 100 células, Gel-seq fornece uma abordagem simples, usando materiais baratos e amplamente disponível.

Protocol

1. preparação da solução química Nota: Os passos seguintes são para a preparação de soluções químicas necessárias em etapas posteriores. Estes podem ser feitos em grandes quantidades e armazenados por vários meses. Para começar, prepare-se 50 mL de água purificada, deionizada esterilização em 254 nm UV reticulação forno por 15 min (15 mJ/cm2 exposição total) neutralizar qualquer DNA contaminante. Calor de 37 ° C para uso em etapas a seguir. …

Representative Results

A separação física dos híbridos gDNA e cDNA/RNA em Gel-seq dispositivo pode ser visualizada através de imagens de gel fluorescente; um resultado representativo é mostrado na Figura 3. Painel A mostra o dispositivo Gel-seq fabricado; falsa cor foi adicionada para distinguir as gel de diferentes regiões. Painel B aparece um close de quatro separações diferentes usadas para validação. A terceira pista, um controlo negativo, representa o plano de fundo…

Discussion

Existem vários passos críticos associados com a fabricação do dispositivo de Gel-seq, bem como o protocolo em si. Durante a fabricação, recomendamos começar com as espessuras de camada prescritos para as diversas regiões do gel. Passamos um tempo significativo teste opções de fabricação diferentes e o protocolo descrito aqui produz os melhores dispositivos para as fitas listadas na tabela de materiais e reagentes. Se pesquisadores usam um sistema alternativo de gaveta, eles podem ser necessá…

Materials

Reagents
Acrylamide Monomer	Sigma Aldrich	A8887-100G
Ammonium Persulfate	Sigma Aldrich	A3678-25G
Ampure XP Beads	Beckman Coulter	A63880	Referred to in the text as solid phase reversible immobilization (SPRI) beads
DNA Gel Loading Dye (6x)	ThermoFisher Scientific	R0611	Referred to in the text as 6X loading dye
Ethyl alcohol	Sigma Aldrich	E7023-500ML
KAPA SYBR FAST One-Step qRT-PCR Kits	Kapa BioSystems	7959613001	Referred to in the text as 2X qPCR mix
N,N′-Methylenebis(acrylamide)	Sigma Aldrich	146072-100G	Also known as bis-acrylamide
NexteraXT DNA Library Preparation Kit (referred to in the text as library preparation kit)	Illumina	FC-131-1024	Includes: TD (referred to in the text as transposase buffer), ATM (referred to in the text as transposase), NT (referred to in the text as transposase stop buffer), and NPM (Referred to in the text as library prep PCR mix)
Nuclease Free Water	Millipore	3098
Protease	Qiagen	19155
SMART-Seq v4 Kit (referred to in the text as whole-transcript amplification (WTA) kit)	Takara/Clontech	634888	Includes: Lysis buffer, RNase inhibitor, 3’ SMART-Seq CDS Primer II A (referred to in the text as RT primer), 5X Ultra Low First Strand Buffer (referred to in the text as first strand buffer), SMART-Seq v4 Oligonucleotide (referred to in the text as template switch oligonucleotide (TSO)), SMART-Scribe Reverse Transcriptase (referred to in the text as reverse transcriptase), and PCR Primer II A (referred to in the text as cDNA PCR primer)
Random hexamer with WTA adapter	IDT	n/a	5′-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTAC-NNNNNN-3′
Sucrose	Sigma Aldrich	S0389-500G
TEMED	Sigma Aldrich	T9281-25ML
DNA AWAY Surface Decontaminant	ThermoFisher Scientific	7010PK	Referred to in the text as DNA removal product
Tris-Borate-EDTA buffer (10X concentration)	Sigma Aldrich	T4415-1L
SYBR Gold Nucleic Acid Gel Stain (10,000X Concentrate in DMSO)	ThermoFisher Scientific	S11494	Referred to in the text as gel stain
Equipment
BD Precisionglide syringe needles, gauge 18	Sigma Aldrich	Z192554	Any equivalent hardware is acceptable
Branson CPX series ultrasonic bath	Sigma Aldrich	Z769363	Any equivalent hardware is acceptable
Empty Gel Cassettes, mini, 1.0 mm	ThermoFisher Scientific	NC2010	Any equivalent hardware is acceptable
Mesh Filter Plate – Corning HTS Transwell 96 well permeable supports – 8.0 µm pore size	Sigma Aldrich	CLS3374	Referred to in the text as 8 um mesh filter plate
PowerPac HC Power Supply	Bio-Rad	1645052	Any equivalent hardware is acceptable
Qubit Fluorometer	ThermoFisher Scientific	Q33216	Any equivalent hardware is acceptable
Vacufuge Concentrator	Eppendorf	22822993	Any equivalent hardware is acceptable
XCell SureLock Mini-Cell system	ThermoFisher Scientific	EI0001	Any equivalent hardware is acceptable
Bio-Rad CFX96 Touch Real-Time PCR Detection System	Bio-Rad	1855195	Any equivalent hardware is acceptable
Amersham UVC 500 Ultraviolet Crosslinker	GE Healthcare Life Sciences	UVC500-115V	Discontinued, any equivalent hardware is acceptable
Gel Doc XR+ Gel Documentation System	Bio-Rad	1708195	Referred to in the text as gel imager
Dark Reader Transilluminator	Clare Chemical Research	DR89	Referred to in the text as UV transilluminator
Ultrasonic Bath	Bransonic	1207K35	Any equivalent ultrasonic bath is acceptable.