用于小鼠心脏研究的光片荧光显微镜技术

摘要

本研究采用双侧照射光片荧光显微镜（LSFM）技术结合光学透明化方法，对小鼠心脏进行研究。

摘要

光片荧光显微镜已广泛用于在微米至毫米尺度上快速获取具有高轴向分辨率的图像。传统的光片技术采用单束照明光垂直照射样品组织。使用单束照明光对大尺寸样品成像时，由于组织对光的散射和吸收，图像中会出现条纹或伪影，并导致分辨率降低。本研究采用双侧照明光束结合简化的CLARITY光学透明技术，对小鼠心脏进行处理。这些技术通过清除心脏中的脂质，实现更深层的成像，并获得超过10 × 10 × 10 mm³的大视野成像范围。因此，该策略使我们能够定量分析心室尺寸，追踪心肌细胞谱系，并在从出生后到成年小鼠心脏中，以足够的对比度和分辨率定位心脏特异性蛋白和离子通道的空间分布。

引言

光片荧光显微镜是一种最早于1903年开发的技术，如今被用于研究基因表达，以及构建组织样本的三维（3-D）或四维（4-D）模型^1,2,3。该成像方法利用一束薄层光线照射样本的单一层平面，使探测器仅捕获该平面的图像。随后可通过沿轴向移动样本，逐层采集每一断面的图像，并在对所获取图像进行后期处理后重建出三维模型⁴。然而，由于光子的吸收和散射效应，光片荧光显微镜的应用目前仅限于厚度为数微米或光学透明的样本¹。

光片荧光显微镜（LSFM）的局限性促使研究人员广泛选择组织光学透明的生物体进行研究，例如斑马鱼。由于人类与斑马鱼之间存在保守的基因，涉及心脏发育和分化的研究通常以斑马鱼为模型^5,6。尽管这些研究推动了与心肌病相关的心脏研究进展^6,7，但仍需在哺乳动物等更高等的生物体上开展类似研究。

由于哺乳动物心脏组织较厚且不透....

方案

所有涉及动物使用的操作程序均已获得加利福尼亚大学洛杉矶分校机构审查委员会（IACUC）的批准。

1. 成像系统设置

注意：参见图1和图2。

1. 取一个具有三个波长的连续波（CW）激光器：405 nm、473 nm 和 532 nm。将两个反射镜（M1 和 M2）相距 150 mm 放置，并将其镜面与光束成 45° 对齐。
   注意：此步骤用于将激光从双侧照明装置中偏转出去。所得光束方向将与初始光束方向相同。
2. 使光束依次通过一个直径为 25 mm 的虹膜光阑/针孔（PH）、一个直径为 50 mm 的中性密度滤光片（NDF）（光密度范围为 0 - 4.0）、一个扩束器（BE）、一个宽度约为 0 - 6 mm 的 30 mm 狭缝（S）以及一个反射镜（M3），所有元件之间相距 150 mm。将反射镜放置为其镜面与光束成 45°。
3. 使光束通过一个距离 M3 为 150 mm 的 50:50 分束器。在分束器前方 150 mm 处放置一个反射镜（M6），并将其镜面与向前发射的光束成 45° 对齐。利用反射光束构成双侧照明光片的一侧。
4. 在分束器另一侧 150 mm 处放置一个反射镜（M4），并将其镜面与从分束器以 90° 角发....

结果

本文所述技术采用双侧照明光束结合小鼠心脏组织样本的光学透明化处理，以实现更深层的成像深度和更大的成像体积，同时保持足够的成像分辨率（图1）。为校准系统，将荧光微珠置于玻璃管内并放入成像系统中。随后在 x-y 平面、y-z 平面和 x-z 平面成像并可视化微珠，以获取系统的点扩散函数（PSF）⁸。当使用甘油作为包埋介质时，系统校准结果显示横向分辨率为 d_lateral ≈ 2.8 µm，轴向分辨率在 XZ 方向为 d_XZ ≈ 17.4 µm，在 YZ 方向为 d_YZ ≈ 17.9 µm⁸。

使用荧光微珠完成校准后，成像系统用于采集出生后1天和7天小鼠心脏的图像（图2）

讨论

本文所述的光片荧光显微镜（LSFM）系统与技术采用双侧照明光束结合光学透明化方法，对小鼠出生后及成年阶段的心脏进行成像。传统的单侧照明光束在穿透较厚或较大的组织样本时，易受到光子散射和吸收的影响^1,3。双侧照明光束可实现对样本更均匀的照明，从而最大限度地减少因单侧照明所导致的条纹状伪影及其他成像伪迹。该技术还可通过调节双高斯光束的位置，增加可成像样本的尺寸⁸。当双光束达到最大间距时，能够对尺寸达数毫米的组织样本进行成像，例如成年小鼠心脏；而单侧照明则仅限于对较小的心脏（如斑马鱼和Drosophila的心脏）进行成像。

在光学不透明的组织中进行荧光成像更具挑战性，因为光散射在组织样本中的分布可能并不均匀。这限制了样本可成像的深度以及荧光成像的效果。因此，通常会使用斑马鱼等天然具有光学透明组织的生物模型⁵。然而，对于皮肤本身不具备光学透明性的生物，已有多种光.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
连续波激光器	Laserglow Technologies	LMM-GBV1-PF3-00300-05	用于激发荧光染料
中性密度滤光片	Thorlabs	NDC-50C-4M	控制进入系统的光量
消色差光束扩束器	Thorlabs	GBE05-A	扩展光束
机械狭缝	Thorlabs	VA100C	控制光束宽度
分束器	Thorlabs	BS013	形成双照明光束
配备1X物镜的体视显微镜	Olympus	MVX10	用于样品观察
ORCA-Flash4.0 LT sCMOS相机	Hamamatsu Photonics	C11440-42U	用于图像采集
丙烯腈-丁二烯-苯乙烯共聚物（ABS）	Stratasys	uPrint	用于3D打印样品支架的材料
荧光聚苯乙烯微球	Spherotech Inc	PP-05-10	用于成像系统校准
硼硅酸盐玻璃管	Corning	Pyrex 7740	用于样品包埋的管材
甘油	Fisher Scientific	BP229-4	样品腔填充介质
磷酸盐缓冲液	Fisher Scientific	BP39920	小鼠心脏冲洗溶液
多聚甲醛	Electron microscopy sciences	RT-15700	第一次孵育溶液
丙烯酰胺	Wako Chemicals	AAL-107	与2,2'-偶氮二(2-甲基丙脒)二盐酸盐混合，作为小鼠心脏的第二次孵育溶液
2,2'-偶氮二(2-甲基丙脒)二盐酸盐	Wako Chemicals	VA-044	与丙烯酰胺混合，作为小鼠心脏的第二次孵育溶液
十二烷基硫酸钠	Sigma Aldrich	71725	与硼酸混合，作为小鼠心脏的第三次孵育溶液
硼酸	Fischer Scientific	A74-1	与十二烷基硫酸钠混合，作为小鼠心脏的第三次孵育溶液
Sigma D2158	Sigma Aldrich	D2158	与PB、Tween-20和叠氮化钠混合，作为折射率匹配溶液
Tween-20	Sigma Aldrich	11332465001	与Sigma D2158、PB和叠氮化钠混合，作为折射率匹配溶液
叠氮化钠	Sigma Aldrich	S2002	与Sigma D2158、PB和Tween-20混合，作为折射率匹配溶液
携带心肌特异性肌钙蛋白T启动子并标记GFP的腺相关病毒载体9	Vector Biolabs	VB2045	与ROMK结合时表达GFP
直流伺服电机执行器	Thorlabs	Z825B	用于样品在光片中轴向移动
K-Cube直流伺服电机控制器	Thorlabs	KDC101	连接电机执行器并控制其运动
Amira	FEI Software	N/A	用于生成二维和三维图像的可视化软件